硼替佐米联合维甲酸诱导GTF2I-RARA阳性急性早幼粒细胞白血病分化和凋亡的作用及机制研究

Retinoic acid (RA) has achieved great success in inducing differentiation of acute promyelocytic leukemia (APL) resulting in high remission rate and improved prognosis, and has become a paradigm of cancer differentiation therapy. However, relapses and RA insensitivity occur in APL, and a few variant APL, such as PLZF-RARA and STAT5b-RARA, demonstrate ATRA resistance. The underlying mechanism for RA resistance is not yet clear. GTF2I-RARA is a novel RARA fusion gene isolated from an RA-insensitive APL patient by our group. Our previous work showed GTF2I-RARA promoted RARA ubiquitination, decreased RARA protein level, thus contributed to RA resistance. Targeting the ubiquitin proteasome pathway (UPP), which is mainly responsible for RARA degradation, by proteasome inhibitor MG132 can stabilize RARA, and synergize with RA in inducing differentiation. In this project, we aim to further study the synergistic effect of bortezomib and RA in inducing differentiation and apoptosis, both in vitro and in vivo, and its underlying mechanism. This study will not only gain new insights into RA resistance, but also provide therapeutic strategies for GTF2I-RARA APL.

维甲酸（RA）诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病（APL），显著提高了APL的缓解率及预后，是肿瘤诱导分化治疗的典范。然而，APL存在复发耐药的问题，且少数变异型APL对维甲酸原发耐药，如PLZF-RARA、STAT5b-RARA APL，耐药机制尚不明确。GTF2I-RARA是本研究组从一例对RA不敏感的APL患者中发现的新型融合基因。在探索该型APL对RA耐药的机制的过程中，我们发现转染GTF2I-RARA后 ，RARA的蛋白水平明显减低，泛素化水平增高，提示GTF2I-RARA促进了RARA的泛素化降解。应用蛋白酶体抑制剂MG132靶向抑制RARA的主要降解途径——泛素-蛋白酶体系统，可稳定RARA蛋白，协同RA诱导分化。本项目拟深入探讨硼替佐米联合RA在GTF2I-RARA APL模式细胞株及动物模型中的诱导分化和凋亡的作用及其机制，对该型APL的治疗有重要意义。

本项目以稳定表达GTF2I-RARA的HL-60细胞株和U937细胞株为GTF2I-RARA急性早幼粒细胞白血病（APL）模型，验证了GTF2I-RARA促进增殖、阻滞分化的表型，明确了融合蛋白 GTF2I-RARA 异常募集转录共抑制复合物阻滞髓系分化、负性调控维甲酸反应元件、促进RARA的泛素化降解参与介导APL发生。实践中我们发现硼替佐米并不能显著协同维甲酸诱导 GTF2I-RARA APL模式细胞株分化，但在较低浓度（2-4nM）即发挥显著的诱导凋亡作用，机制研究发现硼替佐米通过抑制NF-kB促进凋亡。基于目前已有较多文献报道硼替佐米诱导细胞凋亡的作用机制，以及多项临床试验显示联合硼替佐米治疗急性髓系白血病获益非常有限，因此调整了研究方向。为明确GTF2I-RARA融合蛋白异常调控的信号网络，我们应用转录组测序（RNA-seq）及染色质免疫共沉淀结合二代测序（Chip-seq），筛选到RNF8等差异表达基因可能是介导GTF2I-RARA APL发生和维甲酸耐药的下游关键分子，进一步研究发现RNF8表达上调，与RARA、RXRA存在相互作用/共定位，过表达增强RARA k48泛素化修饰促进RARA的泛素化降解，应用siRNA敲减RNF8可稳定RARA蛋白水平、逆转维甲酸耐药。综上所述，本项目在前期基础上进行深入探索，首次发现RNF8是GTF2I-RARA转录激活的关键信号分子，参与介导APL发生及维甲酸耐药，有望成为新的治疗靶点，逆转维甲酸耐药。