Mycrobacterium neoaurum 生物合成AD的产物迁移机制与调控

With the breakthrough in biosynthetic method for C17-side chain derivatives of Androsta-1,4-diene-3,17-dione (AD), the application of AD has extended from huge market-demanded sex hormones to corticosteroids. However, there is an obvious side-reaction catalyzed by KsdD in the AD biosynthetic process, which makes the aim product AD further dehydrogenated to form ADD. According to plenty of previous researches, knockout the KsdD gene failed to inhibit the generation of ADD completely, and decrease the yield of AD. In this up-coming research, we will focus on the key enzyme- - - KsdD in industrialized Mycobacterium neoaurum M3 and its mutant strains. Firstly, metabolic engineering techniques will be applied to elucidate the relationship between the cofactor system in cell metabolic networks and the reaction catalyzed by the KsdD, and then the strategy of KsdD enzyme construction will be proposed. Secondly, three-dimensional structure, the easily mutated genes and regulatory genes in KsdD will be deeply analyzed based on the PCR and other genetic manipulation methods, and transcriptome analysis to elucidate the AD migration mechanism and regulation strategy at the molecular level. Finally, Gene replacement technology will be explored to build a low activity, structural stability and regulable KsdD to obtain excellent industrial strains for AD production. This research will provide theoretical basis and methodological guidance for key resource production technology in steroidal pharmaceutical industry.

雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）C17位侧链衍生物合成技术的突破，使AD的应用从生产具有巨大市场的性激素拓展到皮质激素。AD在分枝杆菌生物合成过程中易发生向下游产物ADD迁移的现象。这种转化反应主要由关键酶KsdD催化。大量研究发现，敲除KsdD基因未能完全切断ADD的生成，并带来目标产物AD生产强度的下降。本课题以工业生产菌种新金分枝杆菌M3及其系列突变菌株为材料，以关键酶KsdD为研究对象，首先采用代谢工程技术阐明KsdD催化反应与菌体代谢网络中辅因子系统的关联，提出KsdD酶的构建策略。采用PCR等基因操作、转录组分析等技术，深入分析KsdD的立体结构、易突变基因和调节基因，在分子水平上阐明AD产物迁移的机制和调控策略。采用基因置换技术，构建低活性、结构稳定和可调控的KsdD，获得生产性能优良的工业菌株，为甾体医药工业迫切需要解决的关键资源生产技术问题提供理论依据和方法指导。

本课题针对生产菌种Mycrobacterium neoaurum TCCC 11028（MNR）生物合成AD的产物迁移和不稳定的关键问题，从转化AD的关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KsdD）的结构基因和代谢调控基因两个方面，分析影响生物酶活性和稳定性的因素。采用双同源重组的方法，成功得到ksdD基因缺失突变株M.neoaurum TCCC 11028 M3ΔksdD （MNR M3ΔksdD）、过量表达突变株（MNR M3ΔksdD::ksdD-MNR）和弱活性（MNR M3）菌株。采用比较蛋白组学的方法，对MNR M3ΔksdD 及 MNR M3ΔksdD::ksdD-MNR蛋白表达进行分析比较。结果表明ksdD的过表达使植物甾醇（PS）侧链降解途径相关蛋白表达下调，同时促进植物甾醇降解KsdD下游相关途径的蛋白表达。KsdD催化反应是积累还原力的过程，与胞内辅酶代谢关系密切，分析辅酶代谢相关途径发现ksdD表达明显提高电子传递过程中NADH脱氢酶蛋白的表达。NADH脱氢酶表达强度的提高可以缓解由于KSDD过表达引起的还原力的积累。同时，实验表明不同KsdD表达水平的三株菌对植物甾醇转化能力相当,并且胞内NAD+/NADH比例差别不明显，表明菌体可以通过自身辅酶调节缓解KsdD过表达引起的辅酶氧化还原力不匹配带来的压力。基于胞内辅酶对代谢调控的分析，对甾醇代谢途径与胞内辅酶NAD+/NADH调控的相关性进行研究。通过辅因子工程手段（添加NAD(H)合成前体物质，异源表达NADH氧化酶，过表达烟酸磷酸核糖转移酶，转化体系中提高溶氧）对胞内NAD(H)含量及比例进行调控，最终产物AD(D)摩尔生成率达到94.9%。其次对新金分枝杆菌 KsdD 结构与活性氨基酸位点解析，以两株在AD和ADD合成能力上具有明显差异的菌株MNR和MNR M3为研究对象，初步分析了点突变造成酶活差异的机理。利用同源模建、分子对接和定点突变技术，确定MNR ksdD酶的关键氨基酸位点（Y125F/Y365F/Y541F），并对MNR KsdD关键氨基酸位点进行了机理分析。根据以上研究，理性设计并采用基因过表达技术构建了ADD生产优良菌株，最终ADD生产纯度达到97.1 %。课题建立了构建高产目标产物菌株的策略和方法, 为甾体医药工业迫切需要解决的关键资源生产技术问题提供理论依据和方法指导。