细菌中聚炔类天然产物的生物合成与酶学机制研究

Polyynes, isolated from a wide variety of plant species, fungi and insects, represent a unique class of compounds with an interesting array of biological activities, such as antibacterial, antimicrobial, antifungal, antitumor, anticancer, anti-HIV and pesticidal properties. Examples of polyynes of bacterial origin are very limited, and their biosynthetic mechanism still remains elusive, in spite that a number of cryptical polyyne biosynthetic gene clusters are uncovered from bacteria via bioinformatic analysis. Burkholderia plantarii DSM 9509 is chosen in this project to investigate the biosynthetic pathway of bacteria derived polyynes. This study would provide insights into the functions and biochemical mechanisms of the biosynthetic enzymes generated from heterologous expression and purification by in vitro characterization, especially for the functions, mechanisms, differences and catalytic sequence of the several fatty acid desaturases, the α/β hydrolase, the rubredoxin and the distinct post modifications of polyynes. On the basis of the biosynthetic mechanism of polyynes, their biosynthetic pathway could be rationally reconstructed to obtain diverse polyyne analogues which have distinct physiological activities and are difficult to synthesize. Furthermore, this research could provide a theoretical principle of the engineering of polyyne-producing strain. In a word, it has important academic significance and application value.

聚炔类（polyynes）天然产物是一类重要的天然产物，广泛存在于植物、昆虫和真菌中。该类化合物具有抗细菌、抗真菌、抗癌、抗HIV及抗虫活性。目前发现的细菌来源的聚炔类天然产物种类很少，且生物合成机制并不明确。本项目拟选择Burkholderia plantarii DSM 9509作为研究对象，对其中的聚炔类天然产物生物合成基因进行异源表达和纯化，通过体外酶学实验确定相关蛋白的功能和天然产物的生物合成途径，探究细菌中聚炔类天然产物的生物合成机制和新型的酶学催化机制，尤其是基因簇中多个脂肪酸不饱和酶与α/β水解酶、红素氧还蛋白的功能、差异和催化顺序，以及不同的后修饰机制。在此基础上，可以对生物合成途径进行合理改造，发现和创造一些具有独特生理学活性和不易化学合成的新型聚炔类天然产物，增加天然产物的结构多样性。此外，本研究还可以为产生菌的工业改造提供理论基础，因此具有重要的学术意义和应用价值。

聚炔类天然产物包含三个或三个以上共轭的炔基，具有刚性的线性碳骨架、较为活泼的化学性质以及独特的生理学活性，例如抗细菌、抗真菌、抗癌、抗HIV及抗虫活性等。天然产物cepacins来源于洋葱伯克氏菌ATCC 39356，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌显现出良好的抗菌活性。该化合物的结构非常独特，含有两个炔基以及一个非常罕见的连二烯结构。推测该连二烯来源于炔基的异构，因此cepacins可能同样属于聚炔类天然产物。目前，对聚炔类化合物的生物合成途径，尤其是连二烯结构的生物合成机制知之甚少。本研究对聚炔基团的生物合成途径进行了初步的探究，为后续研究奠定了基础。.通过全基因组测序，从cepacins产生菌中发现一个聚炔类生物合成基因簇，通过生物信息学分析推测相关基因的功能，推测该基因簇很可能是cepacin的生物合成基因簇。使用Red/ET同源重组技术构建了B. cepacia ATCC 39356的遗传操作系统。在此基础上，对该基因簇内部的基因进行敲除，确定了生物合成基因簇的边界以及所有与cepacin生物合成相关的基因，获得完整的生物合成基因簇。对野生型产生菌进行液体发酵，除cepacin A和B之外，还检测到两种cepacin的类似物，此外，在Δbce-4突变株中检测到一个可能的生物合成中间体，拟对上述化合物进行分离和结构鉴定，但上述化合物均不稳定，分离过程中化合物含量逐渐降低乃至消失，未能分离和结构鉴定。在获得cepacin生物合成基因簇的基础上，对相关基因进行异源表达和纯化，编码非膜蛋白基因和两种膜蛋白基因异源表达后均能获得可溶性蛋白，但另有两种膜蛋白的表达难度较大，纯化效果不理想。之后以化学合成的SNAC-十六烷酸为底物模拟酶催化的真实底物对膜蛋白脂肪酸去饱和酶进行体外测活，但多次尝试后未能检测到蛋白的催化活性，推测原因可能是缺少另外两种脂肪酸去饱和酶，或者未能寻找到真实的酶催化底物。后续拟继续表达纯化相关膜蛋白，优化测活条件，探究相关蛋白的催化功能。