胃溃疡肝郁脾虚证大鼠差异蛋白组学及痛泻要方干预研究

胃溃疡属于典型身心疾病范畴，随着社会竞争日趋激烈，本病与日俱增。现代医学对于其治疗存在溃疡愈合质量欠佳，易复发，副作用大等缺陷，强调整体观的中医药辨证论治对本病具有独特优势。痛泻要方在临床上治疗肝郁脾虚证疗效确切，其治疗机制具有"多因、多效、多靶点"的特点。将蛋白质组学引入中医证候学的研究是探讨胃溃疡肝郁脾虚证实质及中药作用机制的一个新切入点。其整体、动态性的核心思维与中医学"整体观"、"辨证观"等理论体系相吻合。本项目拟从病证结合角度，采用蛋白质组学方法，对胃溃疡肝郁脾虚证及痛泻要方对其干预作用进行研究。实验由体内到体外，从大鼠模型体内胃黏膜组织蛋白质组学水平寻找证候差异蛋白，然后将其基因通过质粒转染至体外培养的大鼠胃黏膜细胞，以验证蛋白质的表达及功能，并探讨痛泻药方干预作用。本研究以期为胃溃疡的预防诊治提供新的预警、诊断标志物和新的药物靶点。

建立阿司匹林诱发大鼠胃溃疡及多种不同应激方法进行情志刺激引起的大鼠肝郁脾虚证模型，通过痛泻要方动物体内给药，研究痛泻要方对肝郁脾虚证胃溃疡动物模型的治疗作用及可能机制。内容包括：研究其对于大鼠溃疡指数、病理损伤程度、胃黏膜细胞增殖及细胞凋亡的影响。采用黏膜损伤评分法研究了痛泻要方对大鼠溃疡指数的影响；采用HE染色病理评分法研究了痛泻要方对大鼠胃黏膜病理损伤程度的影响；进一步采用免疫组化法研究了痛泻要方对大鼠胃黏膜细胞增殖的影响；采用TUNEL染色法研究了痛泻要方对大鼠胃黏膜细胞凋亡的影响；采用大鼠胃窦组织样本iTRAQ蛋白质组学检测方法，探寻差异蛋白表达。结果：痛泻要方能抑制胃溃疡引起的动物体重下降，改善胃溃疡大鼠一般体征，痛泻要方各剂量给药组能明显减轻胃溃疡大鼠的溃疡指数并明显减轻胃溃疡大鼠的胃液酸度，痛泻要方各剂量给药组能明显减轻胃溃疡大鼠的胃黏膜病理损伤程度，并具有明显的量效关系。痛泻要方给药组能明显减轻肝郁脾虚证胃溃疡大鼠的胃黏膜细胞凋亡指数，提高胃黏膜细胞PCNA蛋白表达水平。差异蛋白筛选、Gene ontology分析、差异蛋白pathway分析及基因网络分析表明，痛泻要方对大鼠肝郁脾虚证胃溃疡胃窦部差异蛋白及差异基因的表达水平有明显的修复作用，痛泻要方对大鼠肝郁脾虚证大鼠有机物代谢、大分子代谢、初级代谢、细胞代谢过程、单有机体代谢过程有明显的调控作用，并对Kit受体信号通路、蛋白酶体降解、细胞因子及炎症反应、IL-5信号通路、Omega脂肪酸氧化、MAPK信号通路、mRNA加工、补体活化途径、炎症反应通路、Statin通路、IL-3信号通路、凝血通路、条纹肌收缩、TNF-alpha及NF-kB信号通路、EGFR1信号通路、胰岛素信号通路、胞浆核糖体蛋白等炎症通路、免疫调节通路、细胞增殖及凋亡通路及分子具有广泛的调节作用。初步研究结果表明，痛泻要方对阿司匹林及多种不同应激方法进行情志刺激引起的肝郁脾虚证胃溃疡模型具有明显的治疗作用，其作用机制可能与减轻胃溃疡大鼠的胃液酸度、促进胃黏膜细胞增殖、抑制胃黏膜细胞凋亡有关，肝郁脾虚证胃溃疡发病会导致胃窦组织蛋白组学的显著变化，而痛泻要方对差异蛋白及信号通路具有显著的修复调节作用。