FOXO3a调控ROS在肝细胞肝癌失巢凋亡耐受中的作用及机制研究

Anoikis resistance of tumor cells is the prerequisite for metastasis, hence to investigate the underlying mechanism of anoikis resistance is the key breakthrough to overcome hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis. Previous studies have already demonstrated that upregulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) is one of the key factor for anoikis resistance, of which the mechanism remains unclear. Our previous study showed that nuclear-localized FOXO3a inhibited the upregulation of intracellular ROS induced by suspension culture of HCC cells, and knock-down of FOXO3a induced anoikis resistance in HCC cells; further research demostrated that the subcellular location of FOXO3a was intimately associated with expression pattern of mutant p53 (mutp53) in HCC cells. Based on the above, by lentiviral plasmid transfection and confocal laser scanning, this study will confirm the role of FOXO3a on the regulation of HCC anoikis resistance through ROS in vitro and in vivo, and investigate the effect of endogenous and “hotspot” mutp53 on the regulation of subcellular location and function of FOXO3a in HCC cells by Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and GST-pulldown. The aim of this study is not only to reveal a new mechanism of anoikis resistance in HCC and clarify the role of FOXO3a in it, but also to provide a new therapeutic target for the clinical HCC metastasis.

肿瘤细胞对失巢凋亡产生耐受是发生转移的先决条件，研究肝癌失巢凋亡耐受机制是克服肝癌转移的重要突破口。细胞活性氧簇（ROS）水平上调是肿瘤细胞耐受失巢凋亡的关键因素之一，但其调控机制仍不明确。课题组前期研究表明FOXO3a入核激活可以抑制失巢培养诱导的肝癌细胞ROS水平上调，敲减FOXO3a后诱导了肝癌细胞失巢凋亡耐受；并进一步发现FOXO3a的核定位与肝癌细胞表达突变型p53密切相关。本项目拟利用慢病毒质粒转染和激光共聚焦成像等各种技术，体内外模型证实FOXO3a在肝癌失巢凋亡耐受中的作用，明确FOXO3a对ROS的调控机制，并结合免疫共沉淀、GST-pulldown等技术探讨肝癌细胞内源性及常见热点突变p53对FOXO3a细胞定位及功能的影响。研究结果旨在揭示一个全新的肝癌失巢凋亡耐受机制，明确FOXO3a在其中的作用，可望为肝癌转移临床治疗提供新的靶点。

肝癌细胞的应激耐受是制约当前肝癌治疗的关键因素，课题组分别从肝癌细胞自噬和细胞凋亡两个角度对此展开了研究。FOXO3a作为应激因子参与了肝癌细胞多种生物学行为，包括细胞自噬与细胞凋亡，是当前肝癌治疗瓶颈的重要突破口。课题组依据前期研究，深入研究肝癌索拉菲尼耐药机制，最终得出两个重要结论： .（1）通过体外模拟、体内验证两条通路，应用细胞活力实验、细胞增殖实验、Western blot 实验、透射电镜、双荧光标记技术、染色质免疫共沉淀技术及细胞免疫组化技术，明确了 FOXO3a 在低氧微环境中细胞自噬诱导发生中的作用，表明低氧诱导的细胞自噬是介导肝癌索拉菲尼耐药的重要因素，其中 FOXO3a 在低氧微环境下的异常激活是细胞发生自噬的关键启动因素。深入的研究表明低氧微环境下肝癌细胞 FOXO3a 过度激活会靶向促进自噬相关基因 Beclin-1 的转录，从而诱导细胞发生自噬。抑制低氧微环境中的 FOXO3a 自噬通路的激活可以显著增强索拉菲尼的细胞毒性从而改善了肝癌细胞对索拉菲尼的耐药。 .（2）同样通过体外模拟、体内验证两条通路，应用细胞活力实验、细胞增殖实验、Western blot 实验、细胞流式实验、细胞TUNEL实验、双荧光标记技术、染色质免疫共沉淀技术及细胞免疫组化技术，证实转染miR-24-3p.1 mimics可以有效增强索拉菲尼诱导的细胞凋亡，而单独转染miR-24-3p.1 mimics并不能有效杀伤肝癌细胞。进一步的实验结果表明，miR-124-3p.1联合索拉菲尼可以靶向AKT2诱导FOXO3a去磷酸化，同时靶向SIRT1维持FOXO3a乙酰化，去磷酸化后的FOXO3a表现为细胞核内定位，FOXO3a核内乙酰化会靶向转录凋亡相关基因。MiR-124-3p.1通过选择性调节FOXO3a的翻译后修饰状态，精准激活FOXO3a转录调控细胞凋亡，从而改善索拉菲尼的治疗效果。.研究结果揭示了两条新的且重要的肝癌细胞应激耐受机制，并在机制的探索中完成了闭环研究，针对性的靶点药物的研发将有助于改善肝癌患者的临床预后。