高产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株筛选及其生物转化机理研究

我国传统发酵食品无疑是有益微生物及功能因子的优良来源。本课题前期获得3种豆豉样品对α-葡萄糖苷酶强烈抑制，活性组分MW＜1000D以下，RP-HPLC富集到一活性峰；针对活性组分特征研究表明此组分极性较强，能够耐酸碱，经lipase、α-amylase、β-amylase和trypsin处理后活性并无显著性下降（P<0.05）；研究还发现使用A.oryzae 3.951比使用A.elegans 3.118和R.arrhizus 3.078发酵得到的豆豉抑制活性更强。基于以上研究，本课题进一步探索α-葡萄糖苷酶抑制剂的分子结构，从微观角度揭示其产生机理、作用特性以及抑制类型；从传统发酵食品中筛选优良菌株，探究菌株在抑制剂的生物转化过程中的作用机制，揭示其与酶之间的构效关系；通过动物药理代谢实验研究，阐明此功能因子及自然发酵食品的降血糖功效。

本论文应用前期筛选得到的菌株枯草芽孢杆菌B2(B.subtilis B2)为发酵菌株，制备豆豉样品，比较自制豆豉与市售豆豉对小鼠α-葡萄糖苷酶抑制活性，筛选出具有最强抑制能力的豆豉，分离鉴定α-葡萄糖苷酶抑制因子，从基因水平解释其生成机理。主要研究内容及结果如下：.（1）用枯草芽孢杆菌B2发酵制备豆豉样品，并收集国内不同地区13种市售豆豉样品，采用抑制率法和斜率法两种方法比较自制豆豉与市售豆豉α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中抑制率法设置水提物浓度在10-40mg/mL之间。结果显示，在每一水提物浓度下，自制豆豉均比市售豆豉中抑制能力最强的贵州水豉高10%以上。斜率法结果显示，自制豆豉斜率值达到21.56，为贵州水豉样品的近2倍，SPSS结果显示，自制豆豉抑制α-葡萄糖苷酶能力显著高于市售豆豉。.（2）采用HPLC-ELSD方法检测结果显示，自制豆豉中含有降糖物质1-脱氧野尻霉素（DNJ），且含量能达到0.38%。DNJ是桑叶的主要降糖物质，与桑叶中DNJ含量相比研究发现，自制豆豉DNJ含量处于中等水平。.（3）Gabt1、gutb1、yktc1已经被证实是某些枯草芽孢杆菌和链霉菌产生DNJ的关键基因，为研究本实验室保藏菌株产生DNJ的原因，本实验通过提取其总RNA、反转录、PCR等步骤对其序列进行测定，结果显示，枯草芽孢杆菌B2具有这三个基因，而且与NCBI上三基因序列比较，同源性均在96%以上，从基因水平解释了其产生DNJ的原因。.（4）本实验对接种量、发酵时间、向基础培养基中添加不同物质等关键因素进行了单因素实验，结果显示接种量为7%、后酵时间为6天、加盐量为7%时豆豉达到最大抑制能力，斜率值为39.6。而种子液接种量为3%，发酵时间为4天时，菌液抑制α-葡萄糖苷酶能力最强达到54.8。.（5）该项目研究总结论：实验室前期是筛选得到的枯草芽孢杆菌B2，可以作为高产α-葡萄糖苷酶抑制活性豆豉发酵菌种，并且分基因角度揭示了该种微生物发酵豆豉产生高抑制活性的机理，进一步探索获得最高α-葡萄糖苷酶抑制活性样品的发酵工艺。