Klotho在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中作用及机制研究

The incidence of vascular calcification in patients with end-stage renal disease is very high, but there is a lack of effective intervention measures at present. Uremic toxins are thought to play an important role in the occurrence and development of vascular calcification. Our previous studies have found that the expression of Klotho be reduced and the occurrence of vascular calcification be promoted by indoxyl sulfate. The mechanism of Klotho involved in IS induced vascular calcification is still not clear. Autophage is an important mechanism in vascular calcification, and Klotho can regulate the autophagy process. Thus, we propose that IS induces the occurrence of vascular calcification through vascular smooth muscle autophagy regulated by Klotho. The project intends to clearify Klotho function in pathophysiological process of vascular calcification by RNA interference. We will use IS- Klotho methylation- Klotho protein - Beclin1- autophagy as the main line to study the mechanism of ESRD related vascular calcification. This study will help to reveal the mechanism of vascular calcification in ESRD, and has important theoretical significance and application value, and provides a new idea to the treatment and prevention of ESRD related vascular calcification.

终末期肾脏病患者血管钙化发生率极高，但目前临床缺乏有效干预措施。尿毒症毒素被认为在血管钙化的发生、发展中发挥重要作用。我们的前期研究发现尿毒症毒素硫酸吲哚酚（IS）可下调Klotho蛋白表达并促进血管钙化的发生。而Klotho是否参与IS诱导的血管钙化，其机制又如何，目前仍不明确。血管平滑肌细胞自噬是血管钙化发生的重要机制，而Klotho可抑制细胞自噬过程。由此，我们提出假设IS通过下调Klotho促进血管平滑肌自噬，从而诱发血管钙化的发生。本项目拟在细胞水平通过RNA干扰技术证实Klotho参与血管平滑肌细胞成骨转化的病理生理过程；并应用分子生物学和细胞学相关技术，以IS-Klotho基因甲基化-Klotho蛋白-Beclin1-细胞自噬为主线，深入探讨IS诱导血管钙化的机制。本研究的成功开展将有助于揭示终末期肾脏病相关血管钙化发生发展的机制，具有重要的理论意义和应用价值。

心血管疾病是终末期肾病患者死亡的主要原因，血管钙化是其重要的病理基础。尿毒症毒素硫酸吲哚酚(IS)是终末期肾病患者特征性中膜钙化加速性进展的病理基础。血管平滑肌细胞(VSMC)Klotho低表达是IS诱导血管钙化的重要机制。如何通过表观遗传手段提高血管局部Klotho表达，延缓血管钙化？1. 首先以5/6肾切除建立ESRD大鼠模型，给予硫酸吲哚酚干预后，观察血管钙化程度，证明IS通过Klotho促进尿毒症大鼠血管钙化的发生; 2. 用IS处理体外培养的血管平滑肌细胞，以及应用siRNA干扰Klotho表达，观察血管平滑肌细胞的成骨化程度，证明IS通过Klotho调节血管平滑肌细胞的成骨转化; 3. 体外培养血管平滑肌细胞，应用甲基化抑制剂以及siRNA干扰，观察血管平滑肌细胞细胞自噬的发生验证IS促进血管钙化是通过Klotho调节自噬发生的。通过以上三部分实验研究，我们取得以下研究成果。1. 成功建立尿毒症大鼠模型，发现钙化血管局部Klotho蛋白低表达。进一步通过焦磷酸测序，我们发现钙化血管局部Klotho基因DNA甲基化水平显著升高，并和血管钙化程度显著相关；2. 应用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷后，Klotho基因DNA甲基化水平得到明显抑制，血管钙化也相应减轻；3. 结合表观遗传最新研究进展，我们进一步探索了尿毒症血管钙化过程中组蛋白修饰和RNA甲基化的在其中发挥的作用。本项目揭示了DNA甲基化、组蛋白修饰以及RNA甲基化都参与了Klotho血管钙化低表达，通过表观遗传调控的干预手段可以有效延缓尿毒症血管钙化进程，为ESRD相关血管钙化的防治提供一种新思路。