低温等离子体激发的活性粒子对中华管鞭虾酶促黑变的抑制机理

Melanosis of shrimp, represented by Solenocera melantho, is a difficult problem in the field of preservation of aquatic products. Cold plasma, which can generate active species (RS), is considered as a new solution to melanosis and expected to control the melanosis process of shrimp efficiently and safely. However, due to the unclear mechanism of melanosis inhibition by RS, the regulation of plasma becomes rather difficult. . In this project, dielectric barrier discharge (DBD) will be used to generate cold plasma and it will in turn excite reactive species (RS). The mechanism of melanosis inhibition on S. melantho by RS will be investigated. Reactive species, which play a key role in the melanosis inhibition, will be explicated by tracing reactive oxygen species (ROS), reactive oxygen species (RNS) and so on. Inactivation kinetics model of polyphenoloxidase (PPO), based on dynamic changes of RS complex and interactions among multiple species, will be established. Dynamic mechanism of the effect of RS on PPO activity and melanosis index will be investigated. The variation of enzyme conformation and molecular dynamics path induced by RS will be analyzed. The mechanism of PPO inactivation by specific RS will be revealed from the respect of the change of enzyme structure. Based on the above mentioned researches, the key parameters of DBD will be regulated to enhance melanosis inhibition, which will lay a good foundation for the application of cold plasma to inhibit melanosis of shrimp.

以中华管鞭虾（Solenocera melantho）为代表的虾类黑变一直是水产品保鲜领域的难题。低温等离子体会产生活性粒子，可作为一种新的黑变解决方案，有望高效、安全控制虾的酶促黑变过程。然而，由于活性粒子抑制黑变的机理不清晰，致使等离子体的调控非常困难。. 本项目采用介质阻挡放电低温等离子体激发活性粒子，研究其对中华管鞭虾黑变的抑制机理。通过对活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等的追踪，解析在黑变抑制中起关键作用的粒子；建立基于复合活性粒子动态变化及多粒子相互作用的多酚氧化酶（PPO）钝化动力学模型，解析活性粒子对PPO活性和黑变指数的动态作用机制；分析活性粒子引发的酶构象与分子动力学路径变化规律，揭示特定活性粒子介导的、基于酶结构变化的PPO钝化机制；在此基础上，调控DBD关键参数以强化黑变抑制作用，为低温等离子体抑制虾类黑变的应用奠定基础。

黑变是制约虾捕捞与加工业发展的瓶颈问题，寻找安全、高效的黑变抑制方法是当前虾类保鲜亟待解决的重要课题。而低温等离子体技术在食品保鲜与诱发腐败相关酶的钝化作用受到广泛重视。本项目首先对抑制黑变的等离子体关键活性粒子进行了挖掘，考察了活性粒子对中华管鞭虾黑变抑制效果的影响。结果发现过氧化氢(H2O2)和氮氧化物(NOx)是主要的长效活性粒子，其通过蛋白质结构的破坏等多种机制在酶的失活中发挥了关键作用。我们进一步研究了介质阻挡放电低温等离子体（DBD-ACP）对多酚氧化酶（PPO）活性和动力学的影响。随着H2O2和NOx浓度的增加，等离子体技术可以在50 kV时使 PPO部分失活(高达69%)。通过引入相互作用系数表征各粒子之间的协同或拮抗作用，建立基于不同速率常数、不同互作因子的复合活性粒子钝化 PPO 的多参数动力学方程。PPO的Lineweaver-Burk图分析显示，ACP处理10 min时，Km值和Vmax分别可达56.71 mM和0.01 U/min。.通过探究活性粒子对 PPO 分子量、氨基酸含量、α-螺旋和β-折叠含量以及三级结构的影响，并结合同源建模构建的三维结构分析，揭示了活性粒子对酶构象的作用规律和黑变抑制机制。随着暴露时间的增加，表面疏水性明显增强，而总巯基含量逐渐降低。从圆二色性、原子力显微镜、粒径分布和荧光光谱中得到的数据显示了二级结构的重排和三级结构的破坏。PPO酶热稳定性随着粒径分布结果指示的分子聚集而显著降低。.ACP-3 min组能保持更优异的感官品质，虾头和身体黑点面积明显减小。ACP处理组虾的中华管鞭虾的弹性、咀嚼性和硬度等质构特性较对照组大幅改善。ACP周期处理模式可以有效抑制S. putrefaciens等典型腐败菌的生物膜形成活性，延缓腐败菌在水产品体系中的粘附和渗透。杀菌率高达99.96%，腐败菌的活力降低了85.30%。ACP周期处理通过延长活性物质的暴露时间，强化了杀菌作用。而在ACP周期处理后的中华管鞭虾中，相比一次性处理，虾体保持了更为优异的感官品质（色泽，气味和感官得分）。因此应用ACP来处理中华管鞭虾，具有抑制其腐败菌生长，延缓黑变，延长保鲜期的巨大潜力。