具有降糖活性的胰蛋白酶抑制剂的筛选及其抑制α-葡萄糖苷酶活性的构效关系研究

Plant protein trypsin inhibitors (TI) have potential application values in anti-cancer, anti-inflammatory, disease-resistant, insect-resistant, as well as the treatment of cardiovascular diseases, human acquired immunodeficiency and other malignant diseases. However, for its hypoglycemic activity, although there are some sporadic animal experiments, due to the lack of corresponding molecular targets and their structure-activity relationship studies, the mechanisms of TI on hypoglycemic effect and α-glycosidase inhibitory activity are still in the blank stage..We intend to extract acidic, neutral and alkaline trypsin inhibitors from three species (soybean, potato and flax) by using affinity-purification combined with anion and cation exchange column, and then taking the inhibitory activity of α-glucosidase as evaluation index to analyze whether the inhibitory effect of TI on α-glucosidase activity is universal or specific. Secondly, LUTI, the Linum usitatissimum trypsin inhibitor, was used to analyze the structure-activity relationship between LUTI and α-glucosidase using molecular docking, site-directed mutagenesis and protein interactions technology combining with glycosidase activity assay, which help to further reveal the molecular mechanism of trypsin inhibitors’ hypoglycemic activity.

植物蛋白类的胰蛋白酶抑制剂（TI）具有抗癌、抗炎、抗病、抗虫、以及治疗心血管疾病、人类获得性免疫缺陷症等恶性疾病的潜在应用价值。然而对于其降糖活性的研究，虽有零星的动物实验，但因缺乏对应分子靶标以及彼此构效关系研究，国内外对TI的降糖作用机理以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的分子机制研究目前仍处于空白阶段。. 我们拟通过建立偶联胰蛋白酶的亲和纯化技术，结合阴、阳离子交换柱等两步法获取3个物种（大豆、土豆、亚麻）的酸性、中性、碱性胰蛋白酶抑制剂，以抑制α-葡萄糖苷酶活性为评价指标，分析TI对α-葡萄糖苷酶活性的抑制是否具有普遍性和特异性；其次重点以亚麻胰蛋白酶抑制剂（LUTI）为分子模型，利用分子对接、基因定点突变、蛋白质相互作用分析等技术，结合α-葡萄糖苷酶活性测定，分析LUTI抑制α-葡萄糖苷酶活性的构效关系。本项目的开展有助于揭示胰蛋白酶抑制剂降糖活性的分子机制。

近年来，随着人们生活方式的改变，以及城市化和老龄化进程的加快，肥胖和超重人口数量急剧增加，糖尿病的发病率呈现逐年增高的趋势。早在上世纪70年代，就有报道称大豆中微量的胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗、调节胰岛素失调有一定效果。之后随着蛋白分离纯化工艺的增进，人们相继从大豆、银杏、永川豆豉、紫花芸豆、亚麻等不同植物中提取出具有降糖活性的胰蛋白酶抑制剂，并在动物模型上证实具有降糖功效，但因缺乏对应分子靶标以及彼此构效关系研究，国内外对TI的降糖作用机理以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的分子机制研究目前仍处于空白阶段。本研究利用生物信息学手段，选取亚麻、胡萝卜、荞麦、大豆等物种中Potato I型胰蛋白酶抑制剂进行异源表达，通过比较其糖苷酶抑制活性、胰蛋白酶抑制活性发现Potato I型胰蛋白酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性的抑制不具有普遍性。同时以亚麻胰蛋白酶抑制剂（LUTI）为研究重点，探究其多肽序列与抑制α-葡萄糖苷酶活性的构效关系。通过运用酶动力学分析、分子对接、定点突变等方法阐明了LUTI对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制，Phe47可能是与其结合的重要位点；对胰蛋白酶的抑制类型为非竞争性抑制，Asp46、Phe47、Arg48和Cys49四个位点是与其结合的关键位点。此外，我们还通过凝胶过虑色谱和动态光散射实验验证了LUTI与α-葡萄糖苷酶之间存在互作关系。本项目围绕胰蛋白酶抑制剂的降糖活性及其降糖的作用机理展开研究，首次分析了Potato I型胰蛋白酶抑制剂的降糖活性，证实了其降糖机制为抑制α-葡萄糖苷酶活性且该抑制不具有普遍性，重点分析了胰蛋白酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶抑制的构效关系，这不仅弥补了有关胰蛋白酶抑制剂在降糖功效机制研究上的空白，还为进一步开发以α-葡萄糖苷酶为靶点的植物多肽类降糖药物提供理论指导和依据。