中药单体化合物柠檬苦素靶向VEGF/VEGFR2信号途径的抑癌作用研究

Gastrointestinal tumor is one of the most common malignancies in the world, which can trigger substantial development of new blood vessels in a process called angiogenesis to nourish tumor growth. At present, VEGF/VEGF receptor2 signaling has been a novel and potential target for angiogenesis-targeted biotherapy and drug development. In our earlier study, we found that limonin, a tetracyclic triterpenes active component from folk traditional Chinese medicine plants, strongly inhibited cell proliferation, migration, invasion, and capillary-like tube formation of primarily cultured human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) in vitro in a dose-dependent manner, and dramatically reduced VEGF-triggered neovascularization in mouse cornea in vivo. Additionally, western blot analysis also revealed that limonin suppressed VEGF-induced phosphorylation and activation of VEGF receptor 2 kinase (KDR/Flk-1) with IC50 of 0.5 μmol/L, implying that limonin may be one of efficient tumor angiogenesis inhibitor. Therefore, through working on different platforms that are in vitro, ex vivo and in vivo models, we systematically investigated the biological activities of the compound on tumor angiogenesis, and its role in the improved clinical anti-cancer properties of the first-line drugs for treatment of digestive cancer (such as 5-FU and Cisplatin). These findings may pave a way to better reveal the novel functions of limonin in tumor angiogenesis and its molecular basis for the anticancer action, and thus provide a scientific basis for gene targeted therapy.

消化道肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病。目前，以VEGF/VEGFR2为靶标的抗肿瘤血管生成的生物靶向治疗，已成为继手术、化疗、放疗三种方法后的第四种肿瘤治疗方法。项目前期初步发现源于中药柑橘类桔皮提取物中的天然活性成分四环三萜类单体化合物柠檬苦素能有效阻断VEGF/VEGFR2活化，并可以显著抑制体外VEGF诱导的血管内皮细胞增殖、分化、成管和迁移和阻断体内小鼠角膜血管新生，提示柠檬苦素很可能具有抗血管生成的作用。此外，柠檬苦素可以起到化疗增敏的效果，增强消化道肿瘤临床一线药物5-FU和Cisplatin的体外抗癌疗效。课题组拟通过细胞水平、蛋白水平、计算机模型以及整体动物模型多种途径来研究柠檬苦素抑制肿瘤生长，肿瘤血管新生和肿瘤转移的作用，以期阐明柠檬苦素的抗癌新功能和抗肿瘤新机制，为临床用药和肿瘤个体化治疗提供科学依据，为研制具有我国自主知识产权的肿瘤生物治疗药物奠定理论基础。

肿瘤血管新生和肿瘤转移作为肿瘤的重要标志，是决定肿瘤增殖、分化、侵袭、转移、免疫逃避、复发、化疗耐药及预后的关键因素。研究表明存在于桔皮及柚皮中一种含呋喃环高度氧化的四环三萜类化合物柠檬苦素(limonin)不仅具有抗炎、抗氧化、抗病毒等作用，还可以有效抑制多种人癌细胞的生长，然而柠檬苦素是否可以靶向肿瘤血管新生和转移，国内外相关报道鲜见。在体外水平，利用细胞增殖实验、划痕愈合实验、Transwell小室迁移实验、小管形成实验，研究柠檬苦素在不同浓度下对人源血管内皮生长因子（VEGF165）诱导的人血管内皮细胞（HUVECs）增殖、迁移、分化成管功能的影响；利用细胞增殖实验、划痕愈合实验研究柠檬苦素在不同浓度下对胃癌和乳腺癌多种肿瘤细胞增殖、迁移功能的影响；在体内水平，分别利用基质凝胶植入模型以及裸鼠胃癌腹腔种植转移模型、乳腺癌实验性肺转移模型，探究不同剂量的柠檬苦素抑制肿瘤血管新生和转移的新功能。在分子机制方面，研究利用Western blot、RT-PCR、siRNA等方法探究了柠檬苦素对HUVECs细胞以及肿瘤细胞VEGFR2介导的下游STAT3信号途径相关效应蛋白的干扰作用，阐明柠檬苦素抑制肿瘤血管新生和转移的新机理。结果显示，柠檬苦素浓度依赖性地抑制VEGF165诱导的人血管内皮细胞HUVECs的迁移、侵袭和小管分支状结构的形成以及VEGF165诱导的基质胶血管生成。此外，柠檬苦素显著地抑制多种肿瘤细胞的迁移以及胃癌、乳腺癌的体内转移灶的大小、体积和数目。柠檬苦素可以竞争性地阻断VEGF与VEGFR2激酶活性口袋的结合，抑制VEGFR2和STAT3激酶的磷酸化，上调SHP1的同时降低下游MMP9蛋白的表达，提示柠檬苦素可以通过VEGFR2/STAT3/SHP1途径发挥抗肿瘤血管生成和转移的生物学新功能，具备潜在的临床应用和市场开发前景。