基于呋喃环代谢活化的乌药醚内酯引发CYP2C9机制性失活的机理研究

Furanoids occur in a wide range of herbs, and many of them have been documented as mechanism-based inactivators of cytochromes P450. By application of our developed bromine-based analytical platform, Linderane (LDR) was detected as one of the main furan-containing sesquiterpene components in Lindera aggregata (Sims) Kosterm, which can be metabolic activated. Our early study demonstrated that LDR acted as a mechanism-based inactivator of CYP2C9, and that the enzyme inactivation was associated with the metabolic activation of furan ring of LDR, whereas the definite mechanism involved was not yet clear. We proposed our hypothesis: the nucleophilic groups of the active site of CYP2C9 were covalently modified via metabolic activation of the furan ring，as a result that potential drug-drug interaction (DDI) between LDR and substrates of CYP2C9 may occur. As a continuous work, we will focus on the chemical mechanism of the covalent modification of CYP2C9 by reactive metabolites of LDR; as well as DDI between LDR and substrates of CYP2C9 to further verify the effect of enzyme inactivation by LDR. This application allows us to elucidate the molecular mechanism of CYP2C9 inactivation by LDR and provides common research ideas and methods for investigation of the mechanism of mechanism-based inactivation of P450 enzyme and DDI in clinical caused by furan-containing compounds which can be metabolic activated.

呋喃类化合物广泛分布于各种中药中，该类成分可能被某些P450酶亚型代谢活化并导致酶机制性失活。乌药醚内酯（LDR）是利用前期建立的基于溴元素衍生化的分析平台在乌药中筛查出的可被代谢活化的主要呋喃倍半萜类成分。LDR会使CYP2C9机制性失活，可能与呋喃环被代谢活化有关，但具体机理尚不明确。我们提出科学假设：LDR的呋喃环经代谢活化对CYP2C9的亲核基团发生共价修饰，导致其活性被不可逆抑制，继而可能会与由CYP2C9代谢的药物发生相互作用。本项目在前期基础上，将重点研究LDR的亲电性代谢物共价修饰CYP2C9的化学机制，同时探明以CYP2C9作为主要代谢酶的药物与LDR的相互作用情况以验证LDR对CYP2C9的抑制作用。本课题系统阐明LDR引发CYP2C9机制性失活的分子机理，为研究可被代谢活化的呋喃类化合物产生P450酶抑制的机制，及临床与之相关的药物之间相互作用提供共性研究思路与方法。

很多天然的呋喃类化合物对体内重要的代谢酶—细胞色素P450酶具有机制性失活（MBI）作用，从而产生潜在的药物-药物相互作用（DDI）。本课题前期体外研究证明，乌药中的主要呋喃倍半萜类成分—乌药醚内酯（LDR）对CYP2C9可产生MBI作用。本研究通过体内和体外药物代谢模型，结合蛋白水解技术从LDR亲电性代谢产物与P450酶亲核基团相互作用的层面探明LDR导致CYP2C9机制性失活的分子机制并揭示了体内产生DDI的程度。以GSH为捕获剂发现LDR在CYP2C9重组酶体系中产生了furanoepoxide和γ-ketoenal两种代谢中间体。这些亲电性中间体进一步对CYP2C9蛋白部分的赖氨酸和半胱氨酸残基发生了共价修饰。形成的蛋白加合物的产量具有明显的时间和剂量依赖性，这与LDR在体外引发酶失活趋势一致。而且，在与LDR共孵育后，CYP2C9的铁红素含量也显著降低，即LDR可引发铁红素部分的丧失。分子对接研究显示LDR的呋喃环部分与CYP2C9活性中心的多个关键氨基酸有相互作用和较近的空间距离，进一步印证了呋喃环部分在LDR致CYP2C9酶失活过程中有重要作用。动物体内实验表明LDR可剂量依赖性地致CYP2C9的表达显著性降低。LDR分别与三种CYP2C9底物药物，包括华法林、甲苯磺丁脲和双氯芬酸同时给药后，在大鼠体内抑制了CYP2C9底物药物向相应的羟基化代谢产物的转化。综上所述，本研究表明LDR反应性代谢物通过对CYP2C9的载脂蛋白的共价修饰和致使铁红素丧失引发了MBI，且很可能导致DDI的发生。本课题为研究自然界中广泛存在的呋喃类化合物产生P450酶MBI的机制，及临床与之相关的DDI提供了共性研究思路与方法。本项目的主要研究成果已发表论文7篇，包括SCI论文6篇，中文核心期刊论文1篇；培养毕业硕士研究生1人。