四倍体陆地棉及其A、D亚组近缘祖先种着丝粒序列的发掘与进化研究

着丝粒是真核生物有丝分裂和减数分裂染色体正确分离和传递所必需的染色体结构与功能元件。由于其序列在不同物种甚至同一物种中存在着高度的变异性，导致着丝粒序列定位与发掘的困难，并严重阻碍了遗传图谱、物理图谱构建与全基因组测序等工作的最终完成。目前，棉花着丝粒的相关研究鲜有开展，更未见正式报道。本课题将以现有着丝粒特异克隆为基础：筛选不同棉种材料的BAC文库，并利用荧光原位杂交技术，开展四倍体陆地棉及其二倍体近缘祖先种着丝粒特序列的发掘工作；通过对着丝粒序列的测序，分析着丝粒在不同棉种或进化阶段的序列组成与结构特征。最终，为棉花着丝粒功能序列的克隆提供依据，为棉花遗传图、物理图的构建及全基因组测序工程中着丝粒定位及全序列测定奠定基础。

着丝粒是染色体不可或缺的功能元件，在染色体的分离过程中起重要作用。由于真核生物的着丝粒通常是由高度重复序列组成，相关研究的进展缓慢，其组成及结构之谜仍未能全部解开。本项目旨在开展棉花不同种间着丝粒DNA序列的发掘及比较分析工作，希望能够藉此揭示棉花着丝粒序列的组成、结构以及演化等信息。通过比较分析，我们获得了4个着丝粒 BAC克隆，并从其序列中发现了10个位于棉花着丝粒区的LTR型反转录转座子。分析表明，这些转座子序列成簇的分布在棉花的着丝粒区，覆盖至少1.8Mb的区间，这一点暗示，棉花着丝粒的大小应在2Mb左右。同时，这些转座子序列在A组棉种中呈现出较低的拷贝数或无拷贝的现象，说明四倍体棉花着丝粒的形成经过了一个重组过程，可能主要来自于D组着丝粒。另外，我们也在雷蒙德氏棉近着丝粒区发现了一个串联重复序列。分析表明，其在四倍体棉中移动到了着丝粒区，并且长度从223kb 延伸到了1Mb。这一序列对我们了解着丝粒串联重复序列的形成和演化有着重要的意义。依据上述结果，我们也成功地将D组染色体的着丝粒位置在遗传图谱上标注出来。同时，成功掌握了fiber-FISH技术以及与之结合的染色质免疫染色技术，借此对棉花端粒与5S rDNA的结构及DNA甲基化进行了应用实验，从而更加完善了棉花的分子细胞遗传技术体系。