miR-135b在人牙髓细胞成牙本质向诱导分化过程中的调控作用研究

microRNAs是长度约22个核苷酸，在转录后水平调控基因表达的非编码小分子RNAs。近两年已证实microRNA对成骨分化及骨质形成具有重要的调控作用。牙髓细胞的成牙本质向分化、分泌牙本质基质、形成牙本质与成骨细胞分化、成骨的过程非常相近，我们推测牙髓细胞中亦可能存在microRNA的调控机制。为证实该假想，本课题组前期采用microRNAs芯片技术检测成牙本质向诱导分化过程中人牙髓细胞microRNA表达谱的变化，发现mir-135b表达下调并与多个成骨相关基因相关。以此为切入点，我们拟使用Northern blotting及实时定量PCR检测mir-135b体内外的时空表达模式；利用生物信息学软件预测及荧光素酶报告系统鉴定mir-135b可能的靶基因及其作用位点；上调或抑制牙髓细胞内mir-135b表达，通过功能分析明确mir-135b在人牙髓细胞成牙本质向分化中的调控作用。

microRNA对成骨细胞分化及骨质形成具有重要的调控作用，牙髓细胞的成牙本质向分化、形成牙本质与成骨细胞分化、成骨的过程非常相近，我们推测牙髓细胞中亦可能存在microRNA的调控机制。课题组通过建立牙髓细胞成牙本质向分化模型，采用microRNAs芯片检测成牙本质向诱导分化过程中牙髓细胞microRNA表达谱变化，发现多个microRNA表达差异变化，生物信息学分析显示差异表达的microRNA与细胞分化，干性维持，细胞粘附等多种细胞行为相关，可能参与调控成牙本质关键信号通路(MAPK，insulin，Wnt，adherens junction)，提示成牙本质向分化过程中存在microRNA调控机制；据此，我们使用实时定量PCR检测miR-135b-5p体内外的时空表达模式，转染后上调/抑制牙髓细胞内miR-135b-5p表达，明确其在人牙髓细胞成牙本质向分化中的调控作用，联合生物信息学预测及荧光素酶报告实验预测并验证miR-135b-5p的下游靶基因及其结合位点，结果发现miR-135b-5p抑制DPCs成牙本质向分化标志基因DSPP、ALP、BSA表达及矿化基质形成；生物信息学预测提示miR-135b-5p的下游潜在靶基因是FoxO1，在诱导牙髓细胞成牙本质向分化中，miR-135b-5p表达逐渐降低，FoxO1表达逐渐上调，功能性过表达/低表达miR-135b-5p，FoxO1相对应降低或升高，进一步的荧光素酶报告基因结果显示miR-135b直接靶向结合FoxO1的3’UTR区域，抑制FoxO1表达。提示miR-135b-5p可抑制DPCs成牙本质向分化，该作用可能是通过抑制FoxO1的表达得以实现，这为深入研究牙髓修复再生机制提供新的理论依据。