基于植物代谢组学策略的MeJA对赤小豆萌芽过程的作用机制研究

Plant metabolomics strategy will be used to evaluate the metabolic fingerprint spectrum of Adzuki beans (Vigna umbellata) sprouting process. Ultra-high performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS), coupled with partial least-squares-discriminant analysis (PLS-DA), and principal component analysis (PCA) methods will be used to determine the secondary metabolites biomarkers of MeJA-treatment and control groups of Adzuki beans sprouts. The main enzymes activities involved in the synthesis pathway of the biomarkers will be analyzed and elucidated. In order to elucidate the function mechanism of MeJA on the sprouting process, the main genes expression in the synthesis pathways of the biomarkers were further evaluated by the methods of RT-PCR. Moreover, the antioxidant and anti-allergic activities of the biomarkers will be evaluated to offer the application evidences for MeJA on seed sprouting process.

本课题运用植物代谢组学策略，采用超高效液相色谱四级杆/飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF)建立代谢指纹谱，以此来分析MeJA处理前后不同时间萌芽赤小豆中次级代谢产物，并运用主成分分析PCA和偏最小二乘法判别分析 (PLS/DA)等方法识别分析潜在的生物标记物，解析MeJA对生物标记物代谢与转化途径关键酶的影响，采用实时荧光定量PCR的方法测定MeJA对生物标记物代谢途径中关键基因的调控，阐明MeJA对赤小豆萌芽过程的作用机制，此外通过体外实验测定生物标记物的抗氧化及抗敏活性，为MeJA作为谷物及其他种子萌芽过程生物活性物质诱导剂的应用提供科学依据。

赤小豆为我国传统的食品，传统医学研究表明赤小豆具有清热解毒的功效，同时谷物萌芽过程，由于酶活性的启动，导致抗氧化等活性成分的显著增加，而植物内源性激素MeJA的干预可以进一步促进活性成分的增加。基于此研究背景，为从赤小豆中寻找具有抗敏及抗氧化功效的活性成分，本研究采用MeJA干预赤小豆发芽过程，确定了赤小豆的最佳萌芽工艺；采用非靶向代谢组学（LC-MS）检测赤小豆种子萌芽过程及MeJA干预赤小豆种子萌芽过程的样品的代谢物变化，推测一次代谢产物可能的代谢途径；通过LC/MS法定性检测和HPLC-QQQ/MS法以及HPLC法定量检测MeJA干预前后赤小豆萌芽中酚类、黄酮类和异黄酮类物质，推测MeJA干预的二次代谢产物的代谢途径，对差异性代谢产物进行抗敏及抗氧化测定，并对参与差异性代谢产物转化途径的关键酶的基因表达调控进行研究，阐明MeJA的作用机制。 结果表明：赤小豆的最佳萌芽工艺为料液比1:5提前浸泡6h，恒温25℃，每小时浇水一次，最佳MeJA干预浓度为100μmol/L；萌芽24h、48h与赤小豆种子的显著性差异成共207种，24hMeJA干预前后显著性差异成分共44种，48hMeJA干预前后显著性差异成分共21种；通过数据库检索发现，MeJA主要干预精赖氨酸、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的生物合成以及代谢；赤小豆萌芽中含有的酚类、黄酮类和异黄酮类物质均受MeJA干预影响，在差异性代谢产物中，大豆异黄酮类物质染料木苷、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷等黄酮-3-O-糖苷类化合物为显著具有抗敏及抗氧化活性，基因表达调控结果表明，MeJA导致赤小豆萌芽抗敏及抗氧化差异性代谢产物提升的机制为干预关键酶黄烷酮3-羟化酶（F3H）、黄酮醇合成酶（FLS）和类黄酮糖基转移酶（FGT）、异黄酮生化酶（IFS）酶的基因表达调控导致其活性成分以及相应活性的增加。本研究为赤小豆及其萌芽作为抗敏以及抗氧化功能的食品及化妆品添加剂应用提供科学依据。