基于脉冲超滤液-质联用技术的中药治疗类风湿关节炎药效物质基础研究

Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) have been used to treat rheumatoid arthritis (RA), which lead to adverse reaction in a long term application. It is very important to find high efficient and low toxicity anti-RA drugs. Saposhnikovia divaricata, Carthamus tinctorius and Smilacis Glabrae were commonly used in clinical medicine. Screening and structural characterization of anti-RA constituents from the three plants extracts using ultrafiltration high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The bioactive constituents were then separated by combined medium-pressure liquid chromatography(MPLC) and high performance counter-current chromatography(HPCCC). The RAW264.7 cell experiment and adjuvant arthritis (AA) rats model were further taken out to evaluate the anti-RA activities of effective components. Ultrafiltration LC-MS is a powerful tool to screen biologically active compounds from plant extracts because of its high throughput on-line screening ability, and selectivity necessary. It would be helpful to provide some new methods for screening anti-RA constituents from plants.

类风湿关节炎已成为严重威胁人类健康的主要疾病，临床常用的非甾体抗炎药毒副作用较大。从临床确有疗效的中药中寻找具有高效、低毒的治疗类风湿关节炎的药物已引起广泛关注。中药防风、红花、土茯苓为临床治疗类风湿关节炎组方中常用药。本项目以三种中药中的黄酮类成分为主要研究对象，利用脉冲超滤液-质谱技术在线筛选中药提取物中治疗类风湿关节炎活性成分。采用高效逆流色谱和快速制备色谱技术分离有效单体化合物。在此基础上，利用RAW264.7细胞和大鼠整体关节炎模型对有效单体化合物进行药效学评价，深入研究其作用机制，并验证脉冲超滤质谱筛选实验结果，为脉冲超滤液-质联用筛选方法提供科学依据，为从中药中筛选治疗类风湿关节炎活性成分提供新的研究方法。

类风湿关节炎(RA)是一种以周围关节对称性滑膜炎为主的自身免疫性疾病，而基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、磷酸二酯酶4（PDE-4）和5-脂氧合酶（5-LOX）与自身免疫性疾病的发生密切相关。项目以MMP-2、PDE-4、5-LOX为靶点，应用超滤-液质联用技术，结合体外酶活性实验筛选了防风、土茯苓、红花中抑制不同酶活性成分。研究发现5-O-甲基维斯阿米醇苷、白藜芦醇、红花黄色素B具有很好抑制MMP-2作用；5-O-甲基维斯阿米醇苷、落新妇苷、升麻素苷具有很好抑制PDE-4作用；5-O-甲基维斯阿米醇苷、白藜芦醇、亥茅酚苷对5-LOX具有强抑制作用；中药提取物中成分含量高低与活性不一定呈正相关，如亥茅酚苷、白藜芦醇、红花黄色素B在防风、土茯苓和红花中含量很低，但对5-LOX表现出更强的竞争能力。采用逆流和快速制备色谱技术分离得到11种目标化合物，应用液质联用和核磁技术鉴定了结构。以LPS诱导损伤的RAW264.7细胞为模型，应用MTT法对11种成分进行了细胞活性筛选，发现亥茅酚苷和落新妇苷能显著提高受损细胞存活率，与两种化合物具有强抑制5-LOX作用结果一致，从细胞水平上证明了5-LOX与炎症的发展更为密切；虽然白藜芦醇也具有很强5-LOX作用，但却不能提高受损细胞的存活率。最终选择亥茅酚苷和落新妇苷，采用定量qPCR，WB，Elisa实验，分别在转录水平和蛋白水平上检测了两种药物对炎性细胞因子表达的影响及对相关炎症信号通路的调节作用。发现亥茅酚苷通过降低TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、AKT mRNA、IL-6 mRNA、TNF-a mRNA， pAKT/AKT、pERK/ERK、pNF-KB、TLR4、MyD88蛋白水平，以及降低TNF-a、IL-6含量而发挥抗炎作用。落新妇苷与亥茅酚苷抗炎细胞作用机制基本一致，但对 TNF-a mRNA水平无明显作用。在治疗佐剂型关节炎大鼠的药效学实验中，亥茅酚苷能明显消除佐剂型关节炎大鼠足肿胀程度，降低血清中MDA和NO的浓度，提高机体清除氧自由基能力，升高SOD的活力，呈现出良好治疗效果，研究表明亥茅酚苷有望开发为治疗RA的药物。落新妇苷在实验剂量下治疗效果不明显。