基于NMR代谢组学对肝豆灵排铜作用机制的研究

Wilson's disease is a neurological disease caused by copper dismetabolism. Gandouling tabelet is an effective traditional Chinese preparation in treating Wilson's disease. However, its mechanism of action is still on the exploratory stage. As a systematic biology research method, metabonomics studies the mechanism of drugs on organisms from a holistic, dynamic point of view, which accords with the overall concept of Chinese medicine treatment of diseases. Preliminary studies have shown that metabolites of Chinese preparation can be detected and analyzed through NMR-based metabonomics, analysis of these metabolites can reversely speculate the intervention network of Chinese preparation in vivo, and thus the mechanism of drugs can be analyzed. This study will use NMR-based metabonomics to conduct the following studies: to establish NMR spectroscopy of the treatment mechanism of Gandouling on copper-loaded rat, to conduct qualitative and quantitative analysis on biological metabolites of Gandouling, to screen the characteristic metabolites in model rats' urine and blood that can reflect the curative effect, and analyze the effect of Gandouling on these characteristic metabolites, to explore the metabonomic restoration approach of Gandouling on the model rats, to explore the treatment mechanism of Gandouling on the model rats according to the theory of metabonomics and literatures so as to provide a new idea for researches on mechanisms of Chinese medicine treatment of Wilson's disease.

Wilson病（WD）是一种与铜代谢障碍有关的神经系统疾病，肝豆灵片是中医药治疗WD的有效制剂，但对该复方排铜作用机制的研究仍处于探索阶段。代谢组学技术是系统生物学的研究方法之一，它可以从整体的、动态的角度来研究药物对生物体的作用机制,这一特点非常符合中医治疗疾病的整体观念。前期研究证明，基于核磁共振的代谢组学研究方法可分析出中医复方在生物体内的代谢产物，通过对这些代谢产物的分析，可逆向推测出复方在生物体内的干预网络，进而分析其作用机制。本研究将运用此技术进行以下研究：建立肝豆灵干预铜负荷大鼠的核磁共振谱；对肝豆灵的生物代谢产物进行定性定量分析,筛模型大鼠血清、尿液中能够反应其排铜效果的特征代谢物，并分析肝豆灵对这些特征代谢物的影响；探讨肝豆灵对铜负荷大鼠代谢网络的修复途径；最终，利用代谢组学的理论、参照文献探讨肝豆灵的排铜作用机理，为中医药治疗WD的排铜机制研究提供新的思路和参考。

背景：Wilson病（WD）是铜代谢障碍疾病，肝豆灵片是中医药治疗WD的有效制剂，但对该方的排铜机制研究仍处于探索阶段。代谢组学技术是系统生物学的研究方法之一，其特点与中医治疗疾病的整体观念相符。前期研究证明，代谢组学技术可分析出中医复方在生物体内的代谢产物，通过对代谢产物的分析，可逆向推测复方对生物体的作用机制。.主要研究内容：本项目以NMR和UPLC-Q-Tof-MS代谢组学技术为主，整合了免疫组化、RT-PCR、原子吸收法和生化技术，以铜负荷大鼠的体液和肝、脑、肾离体组织为样品，青霉胺为阳性对照药物，从不同角度测肝豆灵对铜负荷大鼠的影响，系统地分析了肝豆灵的排铜作用机制，取得了一系列的研究成果。.已见刊的重要成果和关键数据：（1）血清。NMR代谢组学结果发现，青霉胺与肝豆灵均可明显调节铜负荷大鼠血清葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酐、胆碱、磷酸胆碱、谷氨酰胺和脂质代谢，具有使其向正常范围回归的趋势。不同点在于青霉胺的排铜机制可能还与调节甲基代谢、调整某些细胞信号识别有关；而肝豆灵片还可调节鸟氨酸循环、支链氨基酸、3-羟基丁酸及氨的代谢。（2）肝脏。NMR代谢组学结果初步鉴定了铜对大鼠肝损伤所涉及的一些代谢物，这些代谢物可能涉及鸟氨酸和三羧酸循环、磷脂、氨基酸（包括支链氨基酸）、能量、核苷酸和糖代谢。UPLC-Q-Tof-MS代谢组学、血清ALT和AST、肝铜、肝组织HE染色、肝细胞凋亡、肝组织Bax、Bcl-2、NF-κB、Caspase-3和miRNA-122结果显示肝豆灵的排铜作用机制可能与下调大鼠肝组织NF-κB、Caspase-3和Bax表达、激活Bcl-2，抑制肝细胞凋亡，升高肝组织miRNA-122的表达，调节胆汁酸代谢、氨基酸代谢和脂代谢有关。（3）肾脏。以TUNEL法测大鼠肾细胞凋亡、NMR代谢组学方法分析肝豆灵干预铜负荷大鼠后，大鼠肾组织小分子代谢物的变化，结果显示肝豆灵可有效抑制铜负荷所导致的肾损伤，其机制可能涉及调节芳香族氨基酸、支链氨基酸和氨的代谢，抑制肾小管上皮细胞凋亡。.科学意义：本项目结果体现了肝豆灵的排铜机制具有多途径、多层次、多靶点的特点，且不同样品之间、同种样品的不同途径之间存在交叉点，所鉴定的一些代谢途径或可初步解释临床对肝豆灵的疗效报道，具有重要的理论意义和临床价值，可为以后对WD铜沉积及其治疗机制的研究提供一定的参考。