基于定量ITRAQ蛋白质组学解析MeJA诱导玉米抗玉米螟分子机制

The role of corn defense proteins and its association with methyl jasmonate (MeJA) induced stress together with insect feeding has no previous reports yet. We have proved that corn growth and development in the MeJA conditions have significant impact on the corn borer by proteomics approach, with clear differences in MeJA induced variation. It also has better anti-feedant activity by screening the defense protein gene expression vector for corn borer in our previous experiments. Because such defense proteins should keep stable to get better defensing activity in insect midgut, we thus apply the main line ITRAQ quantitative proteomics methods to systematically research the behavior of defense proteins in insect intestinal contents under the presence of MeJA and the presence of stress of feeding corn borer. So that we can construct the corn protein library for insect defence system by combining the resulted datasheets with the existing information in GeneBank. Screen and sequence valuable defense proteins. Examine the relationship of their expression profile and levels with MeJA induction and corn borer feeding via PCR and immunoassays. Assay their anti-insect activity by recombinant expression of these proteins in vitro. This project will facilitate comprehensive interpretation of the induced defense mechanisms in plants, and ultimately provide a scientific basis for the use of the plant's own resistance to insects to achieve eco-friendly pest control strategy in agriculture.

我们在前期实验中证明玉米在MeJA诱导条件下对玉米螟生长发育产生显著影响，采用用蛋白质组学方法明确MeJA诱导玉米差异蛋白变化规律，筛选了防御蛋白基因，构建载体表达后对玉米螟具有较好的拒食活性。考虑到该类防御蛋白应该在昆虫中肠稳定存在才能更好发挥抗虫特性，我们将以ITRAQ定量蛋白质组学方法为主线，系统研究MeJA和昆虫取食双重胁迫条件下玉米螟中肠内容物的玉米抗虫防御蛋白质变化规律，以现有蛋白质图谱库和GeneBank数据库信息学数据为桥梁，构建玉米抗虫防御蛋白质分子图谱库，筛选有价值的防御蛋白进行序列克隆分析，采用荧光定量PCR和组织免疫测定等方法在玉米转录和蛋白表达水平阐明该类蛋白与MeJA诱导和玉米螟取食的关系，通过体外表达测定抗虫活性。为全面解析植物诱导防御机制，最终为利用植物自身抗虫性实现环境友好控制农业害虫策略提供科学依据。

本研究通过对亚洲玉米螟抗虫防御机制及对其生长发育影响等方面进行深入分析，利用蛋白质组学方法分析外源茉莉酸甲酯诱导玉米苗期叶片蛋白质组变化，选取差异表达蛋白点进行MS鉴定，根据Mascot数据库检索及生物信息学分析来明确差异表达蛋白的功能信息并筛选重要植物抗虫相关蛋白，构建原核表达载体并进行抗虫活性分析。同时，选取昆虫进化中能够代谢玉米次生代谢物-丁布的主效解毒酶进行基因克隆及序列分析，进而构建RNAi工程菌株，明晰其在虫害治理中的作用。采用高通量双向电泳技术，我们鉴定了64个受MeJA诱导丰度变化显著蛋白质，其中43个蛋白质丰度增加，11个蛋白质降低。同时我们发现8个蛋白质表达与MeJA处理关联一致，所有数据通过ProteomeXchange注册（PXD001793）。通过高通量转录水平测序比较玉米螟取食和外源 MeJA 的玉米幼苗防御反应，在亚洲玉米螟取食和 MeJA叶处理后进行测序。结果表明，在亚洲玉米螟取食、MeJA处理和昆虫与激素协同处理，差异表达的基因有39,636个。通过对上调或下调基因的基因本体富集分析，发现许多基因与代谢过程、刺激反应催化活性和转移活性有关。有15个基因表明亚洲玉米螟摄食组有显著变化: lox1、 asn1、 eif3、 dxs、 aos、 tim、 lox5、 bbti2、 bbti11、 bbti12、 bbti13、 cl-1b、 tps10、 dox 和 a20/an1。