荧光共振能量转移体系用于诊断侵袭性念珠菌病和侵袭性曲霉菌病的研究

Invasive candidiasis (IC) and invasive aspergillosis (IA) are the most common invasive fungal diseases in clinical practice. Due to the current diagnosis methods are difficult to meet clinical needs, IC and IA have high mortality. It is urgent to develop new diagnostic methods with high sensitivity and specificity for rapid diagnosis of IC and IA. In this project, the distance between upconversion nanoparticles (UCNPs, energy donor) and quantum dots (energy acceptor) is shortend by molecularly imprinting technique (IC and IA metabolites enolase and galactomannan as templates respectively), resulting in fluorescence resonance energy transfer happens and fluorescence emission changes. Enolase and galactomannan is detected according to the fluorescence change after the fluorescence resonance energy transfer. Due to the different quantum dots used for the detection of enolase and galactomannan, the fluorescence changes caused by them are different. Therefore, enolase and galactomannan can be detected simultaneously through fluorescence monitoring. The method sensitivity is improved by UCNPs for its anti-interference characteristics. And the specificity is improved by molecularly imprinting technique for its specific adsorption to the target. Because of the improved sensitivity and specificity, this method can be used for early diagnosis if IC and IA and can reduce the mortality rate and diseases burden.

侵袭性念珠菌病IC和侵袭性曲霉菌病IA是临床最常见的侵袭性真菌病，目前的诊断方法难以满足临床需求，易错过最佳治疗时机，病死率高。因此迫切需要研发高灵敏度和特异度的新方法用于IC和IA早期快速诊断。该项目分别以IC和IA代谢物烯醇化酶Eno和半乳甘露聚糖GM为模板制备分子印迹聚合物，通过分子印迹聚合物对目标物的特异性吸附，拉近上转换纳米颗粒（UCNPs，能量供体）与量子点（能量受体）的距离，产生荧光共振能量转移，根据荧光共振能量转移后的荧光变化检测目标物。因检测Eno和GM所用的量子点不同，所引起的荧光变化则不同，可通过荧光监测对生物样本中痕量Eno和GM同步检测。同时利用UCNPs抗生物样品中复杂基质干扰的特性，提高检测的灵敏度；利用分子印迹的特异性识别功能，提高对目标物的吸附、识别能力，提高检测的特异度，从而研发高灵敏度和特异度新方法进行IC和IA诊断，降低病死率，减轻疾病负担。

[项目背景]侵袭性念珠菌病（IC）发病率高，12-24小时的治疗延误可导致病死率加倍。及时诊断和适当的抗真菌治疗是确保救治的关键。因IC的临床表现不具特异性，检测时间长，缺乏灵敏、准确的诊断方法，早期诊断极具挑战性。烯醇化酶（Eno）在白色念珠菌入侵宿主细胞过程中表达明显增加，可区分IC患者与非IC患者，作为诊断IC的重要标志物。.[研究内容]量子点-分子印迹聚合物（QDs@MIPs）与上转换-分子印迹聚合物（UCNPs@SiO2@MIPs）的制备、表征、结合性评价、特异性评价与Eno检测评价。.[研究结果]采用水相合成法制备CdTe-GSH量子点，后将该量子点作为载体，Eno作为模板，3-氨基丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂（模板分子:功能单体:交联剂的摩尔比为1:4000:8000），氨水为引发剂，甲醇-氢氧化钠为洗脱剂，制备了对Eno具有高选择性的QDs@MIPs。QDs@MIPs均为球形且形貌规则，大小为9-14nm。QDs@MIPs在吸附Eno6小时后达到平衡，荧光强度明显下降。相对转铁蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶、人α-烯醇化酶，该材料能对目标物Eno进行特异性识别。线性范围为0.15-3.0μmol/L，检出限为0.05μmol/L，平均加标回收率为101.0％-112.1％。采用溶剂热法成功制备了NaYF4:Yb/Er上转换纳米材料，其荧光性能稳定，形貌规则，呈短棒状，长约70-90nm。并对其进行改性、包硅得到UCNPs@SiO2，硅层厚度约为10-11nm。后将NaYF4:Yb/Er@SiO2作为载体，Eno作为模板，3-氨基丙基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸四乙酯为交联剂（模板分子:功能单体:交联剂的摩尔比为1:4000:6000），氨水为引发剂，合成时间为16h，UCNPs@SiO2用量为50mg，曲拉通为洗脱剂进行反应，通过荧光变化、XRD、FTIR证明成功制备了水溶性UCNPs@SiO2@MIPs。该材料具备良好的特异性，在0.15-3.0μmol/L浓度范围内进行检测，检出限为0.05μmol/L，平均加标回收率为96.6％-100.4％。.[科学意义]鉴于目前侵袭性念珠菌病早期诊断不能满足临床需求的问题，该方法可于感染早期进行Eno检测，并与其他方法联合使用，作为评估侵袭性念珠菌病感染可能性或诊断的潜在方法。