基于多靶标脉冲超滤-质谱技术的参芪降糖颗粒药效物质基础研究

For the scientific issues that it’s difficult to elucidate the bioactive constituents in Chinese herbal formula, and in order to resolve the proprietary of “multi-component, multi-target”, a novel online multi-target pulse ultrafiltration mass spectrometry technology is established. This technology possesses trace pulses ultrafiltration units. Multi active components could be quickly discovered by connecting a plurality of parallel multi-pulses ultrafiltration units. Shenqi Jiangtang Granule (SJG) is a commonly used TCM preparation, but the active components are not clear, which is selected as a representative prescription. Multiple clinical validated hypoglycemic targets are chose as activity index, such as α-glucosidase, aldose reductase, PTP1B and PPARγ, etc. The bioactive constituents in SJG are rapid discovered, and the interaction between the active components and the target proteins are clarified based on the multi-target pulse ultrafiltration mass spectrometry technology. Then, metabolic study of the active components in SJG is implemented through monitoring the changes of chemical constituents in vivo and in vitro. The results of this project will provide a methodology demonstration for the basic research of elucidating the bioactive constituents in Chinese herbal formula.

针对中药方剂药效物质基础难以阐明的科学问题，为了解析中药方剂“多成分-多靶点”的作用特点，本课题拟建立一种新型的多靶标脉冲超滤-质谱在线联用技术，该技术将脉冲超滤单元进行微量化处理，并且将多个脉冲超滤单元进行在线并联，同步实现“多靶标-多成分”的快速发现。本项目选取临床使用频率较高，但药效物质不明的中药降血糖制剂——参芪降糖颗粒为传统代表性方剂，以α-葡萄糖苷酶、醛糖还原酶、PTP1B和PPARγ等多个临床确证有效的降糖靶点作为活性指标，基于多靶标脉冲超滤质谱技术，快速发现参芪降糖颗粒中的活性成分（群），明确活性小分子与各靶标之间的相互作用，在此基础上，对参芪降糖颗粒的活性成分（群）进行体内代谢规律研究，监测化学成分在体内的变化，从体内和体外两方面阐明其药效物质基础。本项目的研究结果将为中药方剂的药效物质基础研究探索一种新思路。

本项目以临床疗效明确的参芪降糖颗粒为研究对象，针对其研究基础薄弱、药效物质不明的现状问题，课题组从化学成分表征、指标成分定量、指纹图谱建立、活性成分筛选、分子对接研究、体内药动学分析及网络药理学等多个方面开展了系统研究。首先，采用UPLC-Q/TOF-MSMS技术鉴定了参芪降糖颗粒中98个化合物，包括37个皂苷类、17个黄酮（异黄酮）类、37个木脂素类和7个其他化合物，进一步利用LC-Q-MS技术的双离子通道监测模式，对复方中10个化合物进行多指标成分定量，明确了参芪降糖颗粒的化学物质基础。结合前期分析条件，采用ChemPatternTM软件建立了可视化的参芪降糖颗粒HPLC指纹图谱，通过计算不同批次的相似度，可快速评价参芪降糖颗粒的批间一致性。其次，建立了一种超滤-质谱联用（UF-LC-MS）技术，从参芪降糖颗粒中筛选出18个潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂和17个醛糖还原酶抑制剂，并进行了单体化合物的体外活性验证和分子对接研究，明确了活性小分子与靶蛋白之间的结合位点和作用方式。第三，采用UPLC-QQQ-MSn技术的母离子和子离子监测模式，对大鼠血浆中的9种微量成分进行药物代谢动力学分析，包括五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛D、五味子甲素、五味子乙素、人参皂苷Rb1、三七皂苷Ft1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re，分别计算各化合物的药-时曲线和药动学参数。最后，基于中药整合药理学平台，选取参芪降糖颗粒中的63个活性成分，以II型糖尿病为疾病靶点，采用DAVID数据库进行信号通路的收集分析，将预测出的作用靶标基因ID输入数据库中，进行KEGG通路注释，筛选得到与糖尿病相关的40条通路，构建了参芪降糖颗粒“复方-药材-化合物-靶点-信号通路”的分子机制网络。基于上述研究结果，本项目系统阐明了参芪降糖颗粒治疗II型糖尿病的药效物质基础，为该品种的质量提升和二次开发提供了大量科学数据。