水稻无侧根基因lrt2的克隆及功能分析

植物主要通过侧根的形成来增加根系的总量，从而增强对水分和矿物营养的吸收。侧根的发育是一个复杂的形态发生过程，其具体机理还不完全清楚。本项目以水稻无侧根突变体lrt2为研究材料，采用图位克隆技术分离lrt2基因，并通过转基因互补和RNAi进行功能验证。同时结合分子遗传学和细胞生物学技术手段分析lrt2基因的生物学功能，筛选并鉴别与lrt2互作的关键因子，阐明Lrt2基因控制水稻侧根发育的分子机理，了解Lrt2基因在生长素信号转导网络中的作用，以此来验证在水稻中是否存在着生长素对植物侧根发育新的调控机制，为单子叶植物根系发育模式有别于双子叶植物提供证据。

通过对生长素不敏感水稻无侧根突变体lrt2（lateral rootless2）的研究，发现Lrt2编码的亲环素蛋白在水稻侧根发育和生长素信号转导中发挥重要作用。突变体lrt2侧根缺失且对生长素不敏感。细胞生物学研究发现，lrt2侧根发育终止于起始阶段，而lrt2对生长素不敏感是因为其对生长素反应减弱。外源生长素处理不能恢复lrt2的侧根发育缺陷表型，表明lrt2的无侧根表型与生长素的生物合成、合成后修饰以及代谢没有直接关系。lrt2对生长素转运抑制剂N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)反应正常，并且lrt2中OsPIN1-like蛋白的极性分布无明显改变，其转录水平与野生型没有差异。由此推测，lrt2对生长素不敏感的表型可能与生长素的极性分布无直接关系，但可能与生长素信号转导受抑制有关。基因克隆和遗传互补结果表明Lrt2编码一个进化上保守的亲环素蛋白（OsCYP2）。Lrt2/OsCYP2在根、基部节间、胚芽鞘和叶片中表达。分析Lrt2::GUS表达模式发现，GUS信号主要集中在根尖基部分生组织区、中柱和侧根原基。原位杂交结果证实Lrt2/OsCYP2主要在侧根原基部位表达。这些结果暗示Lrt2/OsCYP2在侧根起始及其后的发育过程中发挥作用，并可能影响维管束细胞的分裂和分化。亚细胞定位结果表明，Lrt2/OsCYP2蛋白存在于细胞质和细胞核。.为了探索Lrt2/OsCYP2蛋白的功能及其调控的侧根发育机制，我们利用酵母双杂交的方法从水稻cDNA文库中筛选Lrt2/OsCYP2互作蛋白，并将其中一个功能未知的E3泛素连接酶RING-H2命名为CIP1（OsCYP2 interacting protein1）。荧光素互补实验和免疫共沉淀实验证明CIP1和Lrt2能在体内互作。在烟草瞬时表达系统中，CIP1不能促进Lrt2/OsCYP2的降解，并且在Co-IP实验中Lrt2/OsCYP2蛋白没有呈现泛素化修饰造成的弥散状分布。由此推测Lrt2/OsCYP2可能不是CIP1的底物。.综上所述，Lrt2/OsCYP2编码的亲环素蛋白与一个功能未知的E3泛素化连接酶CIP1互作，通过未知的机制调控生长素信号转导，进而控制水稻侧根发育。