黄瓜无卷须基因（td）的克隆及功能分析

The tendrils are thigmotropic coiling organs that aid in mechanical support of vines. However, under the protected cultivation conditions, tendrils not only has lost its proper role, but also adversely affect ventilation and penetrating light of planting group, and discommode field farming operations. Moreover, tendrils intensely compete with female flower in nutrient at the same node of cucumber，thus，the current practice in cucumber production is removal of tendrils by manpower. However, it will inevitably lead to increased of production costs, and therefore tendril-less will be great theoretical and practical significance for cucumber cultivation. The project is applied based on the needs of research and production status of cucumber in china. We has screened a tendrilless mutant(named csem323) by cucumber EMS mutant library. Combined with the findings of preliminary mapping of tendrilless gene (td) , We will clone this candidate gene based on next generation sequencing methods, validate and analysis its function using qPCR, RNA in situ hybridization, gene site diversity analysis, electron microscopy and genetic transformation. The results can not only break through bottlenecks of stem tendrils research and provide the theoretical basis for cucumber breeding and the target gene for directly used for the cucumber breeding, but also have an important reference for the study of cucurbits stem tendril formation and developmental regulation, and also provide basic data for the phylogeny of the cucurbits.

卷须的作用是攀援。保护地栽培条件下，任卷须自由生长会造成株间、株与吊蔓绳之间相互缠绕和遮挡，不仅影响栽培群体的通风与透光，也给植株落蔓等田间管理带来困难；更重要的是它与同节位的雌花有强烈养分竞争，因此去除卷须能显著提高黄瓜产量。生产中为减少养分消耗，便于田间管理，常将卷须摘除，但这种做法势必导致生产成本加大，因此开展无卷须性状的基因挖掘与功能研究对于黄瓜高产省力化栽培极具理论和实际意义。本项目利用课题组创制的无卷须突变体为材料，在无卷须基因（td）初定位基础上，利用二代测序和图位克隆相结合的方法克隆基因；采用qPCR，RNA原位杂交、td序列多样性分析、电镜观察和遗传转化等技术验证td候选基因的功能。该研究结果不仅能为黄瓜无卷须育种奠定理论基础和提供可直接利用的目标基因，而且对于葫芦科其它植物卷须发生和发育调控机制研究也具有重要借鉴作用，同时也能为葫芦科植物的系统演化研究提供基础性资料。

卷须的主要作用是攀援。保护地栽培条件下，任卷须自由生长不仅给植株落蔓等田间管理带来困难，而且它与同节位的雌花产生养分竞争；生产中为减少养分消耗，便于田间管理，常将卷须摘除，但这种做法势必导致生产成本加大，因此开展无卷须性状的基因挖掘与功能研究对于黄瓜省力化栽培极具理论和实际意义。本项目利用课题组创制的无卷须突变体为材料，在无卷须基因td1初定位基础上，利用1个1195株F2代群体，将td1定位在Chr6的190kb的区间，结合BSA-Seq重测序和连锁分析等手段，将CsGCN5基因作为td1的候选基因，并对该基因进行了黄瓜遗传转化验证，但发现CRIPR/cas9转基因阳性植株的表型与突变体表型差异很大，怀疑CsGCN5并不是td1基因。为此，利用2个大群体共10,000余株对td1基因继续进行精细定位，最终将td1基因定位在内含8个基因的58kb区间内,但该区间内已知基因无任何SNP位点；通过BSA-seq和RNA-seq数据分析，发现在td1定位的58kb区间内的CHR4基因外显子序列出现多态性，对CHR4基因进行了克隆，发现该基因的CDS长度为6993bp，在其第5个外显子中，插入了一个长为3412bp的逆转录转座子，致使该基因在其ATPase domain翻译提前终止。通过连锁分析、定位区间内其余7个基因的测序分析等手段，证明CsCHR4是td1最可能的候选基因。对CHR4所在的通路进行了初步分析，发现CsCHR4主要参与了乙烯的响应以及WRKY转录因子的调控及花器官形成和发育相关的转录因子MADS-box基因的调控。显微组织结构观察显示，突变体叶腋处的卷须和生殖器官形成受阻，无卷须的形成主要是分生组织的器官分化出现异常而导致。该研究结果对于葫芦科植物卷须发生和发育调控机制研究具有重要借鉴作用，也可为葫芦科植物的系统演化研究提供基础性资料。