甲状腺激素介导mTOR调控下丘脑kisspeptin基因表达的机制研究

It is known that reproductive function closely links with thyroid function. The thyroid hormone receptors were shown expressed in the GnRH neurons and its upstream neurons kisspeptin neurons, which suggesting that thyroid hormone may directly regulate genital center. mTOR is a signaling molecule reflecting the state of cellular energy metabolism, activation of hypothalamic mTOR can promote kisspeptin expression. Our previous study found that another cellular energy sensor AMPK mediated Sp1 regulation of hypothalamic kisspeptin transcription. It is speculated that thyroid hormone regulate the transcription of kisspeptin through mTOR-Sp1 in the hypothalamus. First, we would observe the effect of thyroid hormone on kisspeptin expression and transcription in the hypothalamic GT1-7 cells in vitro, and explore the molecular mechanism of Sp1 translocation mediated by mTOR. Then, the effect of thyroid hormone intracerebroventricular injection on the reproductive function of female rats would be detected in vivo. And the changes of kisspeptin expression in the hypothalamus and reproductive function of the conditional hypothalamic kisspeptin neurons thyroid receptor knockout mice would be observed. This would be of great significance to reveal the relationship between thyroid function and reproductive function, and be helpful to prevent and treat thyroid-related reproductive diseases.

甲状腺功能与生殖关系密切，GnRH神经元及上游kisspeptin神经元均有表达甲状腺激素受体，推测甲状腺激素可能直接调节生殖中枢。mTOR是细胞能量代谢状态的反映，激活的下丘脑mTOR可促进kisspeptin表达，我们前期研究发现，AMPK可介导Sp1调控下丘脑kisspeptin的转录，故推测甲状腺激素可能通过mTOR-Sp1通路调控kisspeptin的转录。本课题首先在体外观察甲状腺激素对下丘脑GT1-7细胞kisspeptin转录和表达的影响，并探讨其介导mTOR影响Sp1转位改变kisspeptin转录和表达的分子机制；然后在体内观察侧脑室内注射甲状腺激素对雌性大鼠生殖功能的影响，并观察下丘脑kisspeptin神经元特异性甲状腺受体敲除小鼠下丘脑kisspeptin的表达变化及生殖功能改变，这对揭示甲状腺功能与生殖之间的关系以及甲状腺相关的生殖疾病的防治都有重要意义。

背景：甲状腺激素在中枢调节生殖功能的研究还较少。主要研究内容：观察T3对下丘脑 GT1-7 细胞 kiss-1基因转录和表达的影响，并探讨其分子机制；观察侧脑室内注射T3对雌性大鼠生殖功能的影响，并观察下丘脑 kisspeptin 神经元特异性甲状腺受体敲除小鼠下丘脑 kisspeptin 的表达及生殖功能改变。重要结果：体外实验： T3 干预 GT1-7 细胞可以引起KISS-1基因及 kisspeptin 蛋白表达上调，主要是通过增强KISS-1基因的启动子活性来实现的。这些作用可被PI3K/Akt的抑制剂（wortmannin和LY294002）、mTOR的抑制剂（rapamycin）所阻断。免疫共沉淀显示血浆中的TRβ1可直接与PI3K的p85α亚基相互作用。T3可增加PI3K的活性，导致其下游的Akt和mTOR的磷酸化。对kiss-1基因启动子的缺失分析实验表明，T3增强其启动子活性是依赖于-191到-100的SP1结合位点。T3可以引起SP1的核转位，而rapamycin和LY294002抑制SP1核转位。EMSA实验表明，SP1能与KISS-1基因启动子的-191到-100bp相互作用；T3可使SP1与该片段结合增强，而rapamycin和LY294002则减少了他们的结合。体内实验:急性实验：小鼠侧脑室 T3 的瞬时注射可以引起小鼠下丘脑 KISS1 基因及 kisspeptin 蛋白表达增加。慢性实验： 小鼠侧脑室置管药物干预 1 周后， IT 组小鼠体重明显增加，而 IR 组小鼠体重明显减轻 。IT 组小鼠在 TSH、 FT4 及 LH 水平上均低于对照组，但 E 水平高于对照组。 IR 组小鼠 TSH 水平亦下降。 IT 组小鼠下丘脑 KISS1 基因及 kisspeptin蛋白表达较 IN 组减少；IR 组 小 鼠 下 丘 脑 KISS1 基 因 及kisspeptin 蛋白表达亦较 IN 组明显减少，IT 组与 IR 组在下丘脑Kiss1 基因及 kisspeptin 蛋白表达上无显著差异。 基因敲除小鼠8只中仅有3只出现动情周期紊乱，其余5只均可见规律、完整的动情周期，对照组6只小鼠均可见规律、完整的动情周期；2月龄基因敲除雌鼠血清FSH水平较对照组雌鼠显著降低。意义：对甲状腺相关的生殖疾病的防治有重要意义。