锌离子抑制细胞和组织吸收三价无机砷机制研究

Arsenic is a toxic metalloid element and ubiquitous in the environment. The initial step in arsenic toxicity is uptake into cells, trivalent inorganic arsenic（iAs(III)） was transported by aquaglyceroporin channels on cell membrane, therefore, the aquaporin inhibitors may inhibit uptake of iAs(III) in the cells. The action of Zn2+ on channel protein is generally mediated by complexing zinc ions with cysteine or histidine residues. In this project, we will study if the uptake of iAs(III) in the cells and tissues is inhibited by Zn2+ and the mechanism of Zn2+ inhibition. The cell lines of endogenous aquaglyceroporins expression or stable over-expression aquaglyceroporins are used to check if Zn2+ inhibits uptake of iAs(III) in these cell lines mediated by aquaglyceroporins. Mice are exposed to Zn2+ and iAs(III), and determine if Zn2+ inhibits uptake of iAs(III) in tissues of the mouse. The inhibition of iAs(III) uptake by Zn2+ is compared in the presence or the absence of histidine or cysteine modifying agents in stable over-expression aquaglyceroporin cell lines and to determine which amino acid interacts with Zn2+ in aquaglyceroporin protein, then mutated cysteine or histidine in the aquaglyceroporin by the site-directed mutagenesis and to determine which cysteine or histidine interacts with Zn2+ in aquaglyceroporin protein. This project may provide a good way to prevent arsenic lesions in the area of arsenic pollution and the side-effects of iAs(III) as cancer chemotherapeutic agent. Because the structures of microbial, animal, and plant homologs in the aquaporin family points to highly conserved structural features, the uptake of iAs(III) in plants may be inhibited by Zn2+, and it is possible to decrease the level of iAs(III) in human and animals through food chain.

砷是一种分布广毒性大的环境毒物，三价无机砷经细胞膜上的水甘油通道蛋白转运入细胞引起细胞毒性作用，因此水甘油通道蛋白抑制剂可抑制三价无机砷进入细胞。锌离子能与膜通道蛋白中的半胱氨酸或/和组氨酸残基结合而影响膜通道蛋白功能。本项目探讨锌离子是否抑制细胞和组织吸收三价无机砷并研究其抑制机制。利用内源性表达和稳定表达外源性水甘油通道蛋白的细胞，观察锌离子对细胞通过水甘油通道蛋白吸收三价无机砷的作用；利用动物试验观察锌离子对小鼠各组织吸收砷的作用；在表达水甘油通道蛋白的细胞中，加入半胱氨酸或组氨酸修饰剂和锌离子，确定与锌离子相互作用的氨基酸种类；基因点突变特定部位半胱氨酸或组氨酸，确定锌离子与水甘油通道蛋白上氨基酸结合的位置。本项目的研究成果将可用锌离子预防人和动物砷中毒及预防砷治疗肿瘤的副作用。由于水通道蛋白在微生物、植物和动物细胞中的高保守性，通过锌离子抑制植物吸收砷，可减少机体砷摄入。

一次性灌胃给予小鼠一定剂量锌离子和三价无机砷后，小鼠肝、肾、心脏等多个组织吸收砷含量降低，经饮用水给予小鼠不同浓度锌离子和三价无机砷，30天、90天和180天后，小鼠肝、肾、心脏等组织中砷含量均明显低于不给锌离子组。CHO细胞过表达三价无机砷进入细胞的通道蛋白质基因AQP3、AQP7和AQP9后，吸收三价无机砷的量明显增加，其三价无机砷的细胞毒性也明显增加。锌离子能有效地抑制过表达人和小鼠AQP9和AQP7基因的细胞吸收三价无机砷，而不能抑制人和小鼠AQP3过表达细胞吸收三价无机砷。突变人AQP9和AQP7蛋白质中的每一个半胱氨酸，AQP9第213位和AQP7第184位半胱氨酸突变后，降低了锌离子抑制过表达细胞吸收三价无机砷的能力。这些研究结果说明锌离子通过与AQP9及AQP7特定部位的半胱氨酸结合，影响了AQP9和AQP7的功能，从而阻止了三价无机砷进入细胞和组织。这些结果的意义：其一，在饮用水高砷区加入一定量的锌离子，抑制机体吸收三价无机砷，可能起到预防砷中毒的作用；其二，三氧化二砷治疗白血病病人，给予一定剂量的锌离子，可能会防止砷副作用的发生。研究I型糖尿病小鼠和正常小鼠暴露相同剂量三氧化二砷发现，I型糖尿病小鼠肝、肾、心、脾、脑等多个组织中砷含量明显高于正常小鼠相应组织，糖尿病小鼠组织中AQP7、AQP9、GLUT1 mRNA和蛋白质的表达水平均明显增加，说明Ｉ型糖尿病改变了机体基因表达水平，从而增加对三价无机砷的敏感性。另外，利用本项目的资助，研究了三氧化二砷引起神经小胶质细胞炎症和凋亡的分子机制，研究发现，三氧化二砷通过Akt/NF-κB信号通路引起神经小胶质细胞炎症，通过p38/JNK MAPK/STAT3信号通路，诱导小胶质细胞凋亡。这些结果对阐明三氧化二砷对神经系统损伤有重要意义。