基于蛋白质组学铵盐干扰红曲黄色素合成机理的研究

Monascus anka mutant with high ability of yellow pigments production and no or little ability of citrinin production screened by physical and chemical combination mutagenesis was used as researching object, the research, including the relationships between yellow pigments and related primary metabolites and enzyme, the relationships of three monascus pigments, the intracellular protein proteomic analysis of Monascus anka mutant, have been carried out under ammonium salts conditions by proteomics and enzymology, the aim is to find out the key enzyme for yellow pigments production by Monascus anka mutant under ammonium salts condition, and then make clear the regulation mechanism of ammonium salts for yellow pigments production by multi-scale method. The researching results have very important theoretical and realistic significance for realization the monascus yellow pigments industrial production by submerge culture.

本项目以自主选育的高产黄色素且不合成或低合成桔霉素(通过HPLC检测不到桔霉素的存在)的红曲霉突变菌株(Monascus anka mutant)为研究对象，以铵盐作为特殊环境因子，运用蛋白质组学和酶学等研究手段，探讨铵盐条件下红曲黄色素与相关初级代谢产物和各种酶系之间的关系、红曲色素次级代谢产物之间的相互关系以及进行红曲霉突变菌株胞内蛋白质的蛋白质组学分析，目的是寻找决定红曲色素合成分支途径的关键酶，进而多尺度弄清铵盐调控红曲霉突变菌株合成黄色素的机理。研究结果对于提高黄色素的代谢生成量，指导通过调控中间代谢产物从而对黄色素的产生进行调控和早日实现红曲黄色素液态发酵的工业化生产等方面都具有十分重要的理论和现实意义。

红曲色素作为一类传统的天然色素被广泛应用于食品着色剂领域。红曲霉可产生红、橙、黄三种色素，其中红色素已经实现了大规模工业化生产，但对于红曲色素生成机理尚处在研究初级阶段。本课题以混菌培养与液态发酵方法，以红曲色素为目标，开展混菌培养及铵盐限制性条件下红曲色素代谢合成影响的研究。在铵盐限制性条件下，测定了色素色价、色素促进率、己酸含量、辛酸含量，并通过SWATH技术解析差异蛋白，初步探讨红曲色素合成机理。主要研究结果如下：.1、混菌培养结果表明，黑曲霉对红曲橙、黄色素有强促进作用，胞内橙色素、黄色素促进率分别达到97.07%，50.00%。大肠埃希氏菌、纳豆芽孢杆菌对红曲红色素代谢生成有明显影响，接种距离越近，红色素的代谢生成量越高。.2、利用液态发酵方法，以红曲黄色素为目标，将黑曲霉与红曲霉进行液态发酵，初步探讨黑曲霉对红曲色素合成的影响。在红曲霉发酵36 h后接种0.8% 黑曲霉继续发酵，对红曲色素的生成促进率较高。初步确定是黑曲霉本身对红曲霉形态影响和黑曲霉所代谢产生的酶可能是促进红曲色素生成的主要原因。.3、在铵盐限制性条件下，研究发现红曲霉在发酵前期(0-24 h)和发酵后期(72-120 h)会大量利用铵盐，铵盐含量下降，在发酵后期(72 h-144 h)有大量色素生成，对照组色素生成量高于铵盐组色素生成量，是由于铵盐限制了色素生成前体脂肪酸。同时，对照组在发酵前期(0-48 h)会有大量己酸和辛酸合成，己酸和辛酸含量分别达到41.97 mg/L和40.85 mg/L，红曲霉在发酵后期会对这两种脂肪酸进行利用生成相应红曲色素，导致其含量降低；铵盐组中，辛酸和己酸含量都较低，己酸和辛酸最高含量分别为31.39 mg/L和26.05 mg/L，因而相应红曲色素合成量也较低。.4、利用SWATH定量蛋白质组技术，通过GO富集分析，发现差异蛋白主要涉及代谢过程，细胞通讯及代谢等过程。实验成功获得乙酰辅酶A羧化酶、α-亚基脂肪酸合酶和醛脱氢酶以及一些糖酵解酶等相关蛋白质的定量，并发现铵盐组中这些蛋白质表达水平与对照组有显著差异。差异蛋白主要影响糖酵解途径、三羧酸循环、脂肪酸代谢途径，铵盐条件下使控制糖酵解途径和三羧酸循环的蛋白质表达上调，控制脂肪酸合成和代谢途径的蛋白质表达下调。. 研究结果对红曲色素合成代谢机理提供了理论基础，为红曲黄色素的工业化生产提供了技