基于蛋白组学的紫红曲霉中红曲色素生物合成分子机制研究

Monascus pigments have been widely used in food industry and other fields as safe natural colorants in the world. This secondary metabolite is synthesized by a polyketide pathway in Monascus. However, the multienzyme system and the core reactions they catalyzed that are involved in the biosynthesis of Monascus pigments have not been studied clearly. In this study, the proteomics technique is used for establishing the protein expression profiles of pigments high-yield strain Monascus purpureus Y66 and its mutants including the albino strain, the red pigments high-yield mutant, and the yellow pigments high-yield mutant. The possible multienzyme system involved in the pigments biosynthesis will be screened and recognized through comparison analysis of the proteins with differential expression. Then the genes encoding the key enzymes will be located and cloned from the chromosome using PCR and RACE methods. Furthermore, functionality verification analysis of the key enzymes will be performed by gene site-directed mutagenesis and over-expression. The research results will lay a crucial foundation for illuminating the molecular mechanism and revealing the metabolic network of pigments biosynthesis in M. purpureus. And this study will also provide necessary technical supports for the microbial cell plant design to produce the colorants of high purity, which is of important theoretical research value and application prospect.

红曲色素是广泛应用于食品和化妆品等领域的天然色素，该次生代谢产物是红曲菌通过聚酮体代谢途径进行合成，但其生物合成过程所涉及的多酶体系及其催化的关键反应目前仍未研究清楚。本项目拟采用蛋白组学技术，建立高产红曲色素菌株Monascus purpureus Y66及其突变体（白化株、高产红色素突变株和高产黄色素突变株）的蛋白表达图谱，比对分析差异表达蛋白，筛查和识别红曲色素生物合成相关的多酶体系；定位关键酶的编码基因（簇），利用PCR和RACE技术获得基因全序列；进一步通过基因定点突变和超量表达对关键酶的功能进行鉴定分析，解析紫红曲霉中红曲色素生物合成分子机制。本研究将为全面揭示红曲色素生物合成代谢网络奠定重要基础，为细胞工厂的定向设计和高纯度单一红（黄）色素产品的生产提供理论依据和技术支持，具有重要的研究价值和应用前景。

红曲菌（Monascus spp.）是我国传统的药食两用微生物，其产生的天然食用色素—红曲色素广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。红曲色素的合成及其调控比较复杂，目前仍未完全研究清楚。本项目拟采用蛋白组学技术，解析与色素合成密切相关的重要酶类，探究色素合成和调控机理。项目首先分离筛选出色素高产紫红曲霉菌株RP2，其红色素的色价峰值约为750 U/mL，黄色素的色价峰值约为600 U/mL。利用Illumina HiSeq PE150和PacBio RSII测序平台对RP2菌株的全基因组进行了测序、组装和功能注释，获得了RP2中色素合成PKS基因簇的结构与基因序列信息，通过序列比对发现PKS基因簇具有较高的保守性。利用基于串联质谱方法的蛋白质定量技术（iTRAQ）对色素合成不同时期的全蛋白表达图谱进行绘制和差异表达蛋白比对分析，共鉴定到2334个蛋白，96个差异表达蛋白可能与色素合成具有密切相关性，其中包括多种参与氨基酸代谢的酶类。Gene Ontology和KEGG Pathway分析表明，色素合成过程中氧化还原酶活性显著，且与TCA循环、丙酮酸代谢、碳代谢、脂肪酸降解、氨基酸代谢、含硒化合物代谢、芳香化合物降解、次生代谢产物合成等代谢途径紧密关联。项目进而探究了不同氨基酸对RP2中色素合成的调控效应，结果表明，组氨酸显著促进色素合成，蛋氨酸和半胱氨酸显著抑制色素合成；在一定作用浓度范围内，氨基酸添加浓度与其对色素合成的调节效应强度呈正相关；组氨酸和蛋氨酸的添加影响PKS基因簇上聚酮合酶、氧化还原酶、氨基氧化酶、转录调控因子等基因的转录，从而影响色素合成。项目利用组学方法鉴定了紫红曲霉RP2中参与色素合成的重要酶系，初步揭示了色素合成与其他代谢之间的紧密联系，阐明了氨基酸对色素合成的调控效应及其作用规律，探究了其可能的调控机理；研究结果将为全面阐明红曲色素合成及其调控机制奠定重要基础，为开发高附加值单一色素组分产品提供技术支持，具有重要的理论研究价值和应用前景。