稻瘟菌无毒基因AvrPiz-t和水稻抗稻瘟病基因Piz-t介导的抗病机制的分析

植物抗病（R）蛋白与病原菌无毒基因（Avr）编码的蛋白通过直接或间接的相互作用从而诱导基因对基因的植物抗病免疫反应。R基因和Avr基因之间的相互作用机制和互作后所诱导的抗病反应信号一直是植物抗病免疫反应的研究热点之一。本研究利用实验室已克隆到的稻瘟菌无毒基因AvrPiz-t和其对应的抗病基因Piz-t作为研究对象，利用酵母双杂和双分子荧光互补技术（BiFC）分析它们之间的分子互作机制。同时，我们通过分析和鉴定三个AvrPiz-t的互作蛋白的功能，来阐释AvrPiz-t和Piz-t所介导的水稻抗稻瘟病的分子机制。已有实验结果表明AvrPiz-t在Piz-t不存在的条件下，可能作为致病因子促进稻瘟菌的致病性。本研究利用含AvrPiz-t的转基因水稻来进一步分析AvrPiz-t的致病因子的功能。

利用转基因的方法，分别创制了稻瘟菌无毒基因AvrPiz-t的三个水稻互作蛋白基因的过量表达和RNAi沉默的转基因水稻，利用无毒和有毒菌株接种分析发现，APIP3，APIP12的过量表达或沉默不影响Piz-t介导的抗性机制，这些结果表明，APIP3和APIP12可能并不参与Piz-t介导的抗病反应。但是APIP12的RNAi沉默植株对稻瘟菌的非小种抗性明显降低，而且沉默植株开花期显著延后，这说明了，APIP12作为正调控基因，参与了水稻基础抗性，同时APIP12可能参与了对水稻开花的调控过程。酵母双杂分析发现，APIP12的C端的Nucleoporin2结构域并不参与和AvrPiz-t的互作，其蛋白的中间部分是与AvrPiz-t互作的区域。有意思的是，APIP12的N端与另外两个APIP蛋白，即APIP6和APIP8存在着相互作用。RT-PCR分析发现三个APIP基因在水稻与稻瘟菌互作过程中存在着表达的变化，进一步说明了它们参与了水稻抗病过程。AvrPiz-t的转基因水稻相对于非转基因水稻，对有毒菌株的抗性显著降低，这说明了AvrPiz-t作为毒基因降低了植株的基础抗性，进一步证实了AvrPiz-t作为毒蛋白的功能。利用烟草瞬时表达系统，初步发现APIP3可能是一个叶绿体蛋白，而APIP12的亚细胞定位并不清楚。另外，通过与其他课题组合作，完成了另一个APIP蛋白，即APIP6的功能分析，发现APIP6作为一个E3泛素连接酶，参与了水稻的基础抗性。利用核磁共振技术，分析了AvrPiz-t的高级结构，发现AvrPiz-t存在着两个ß折叠。AvrPiz-t的成熟蛋白中包含的四个半胱氨酸残基只存在一个双硫键，另外两个半胱氨酸残基处于还原状态。功能互补分析发现，4个半胱氨酸残基对于AvrPiz-t的功能都是必需的。