小橡胶粒子膜蛋白SRPP在天然橡胶生物合成和调控中的作用

Rubber particle is a kind of special organelle with the effect of natural rubber biosynthesis. Past researches had suggested that nature rubber synthesis was mainly completed by rubber elongation factor (REF) on the particle membrane, and another rubber particle membrane protein (SRPP) played a supplementary role. However, the results of our proteomics and molecular biology studies and some recent papers provide a clue that the key enzyme of rubber synthesis may not only be REF; the more important enzyme may be SRPP, which regulates rubber synthesis speed through phosphorylation; REF may work as an assistant factor to SRPP, positively regulates rubber synthesis when SRPP is insufficient and rubber poorly accumulate, and suppresses rubber synthesis through a feedback mechanism when rubber excessively accumulate. In this project, we intend to use molecular biology, biochemistry, and other related techniques to separate SRPP; observe the expression of SRPP under mechanical wounding, jasmonic acid and ethylene treatment; carry out pilot study of structure and function of SRPP. These prospective results will be helpful to the function study of SRPP, elucidate the specific regulation mechanism of SRPP in rubber biosynthesis and provide new theoretical proofs to further reveal the regulation mechanism of natural rubber biosynthesis.

橡胶粒子是天然橡胶生物合成的特殊细胞器，过去的研究认为，橡胶合成主要由橡胶粒子膜上的橡胶延伸因子（REF）来完成，位于橡胶粒子上的小橡胶粒子膜蛋白（SRPP）则起辅助作用。我们前期的蛋白质组和分子生物学研究结果及最近发表的文献显示，REF可能并不是橡胶合成的唯一关键酶，橡胶合成更重要的酶很可能是位于小橡胶粒子膜上的SRPP，该蛋白很可能通过磷酸化调控橡胶合成速度；REF则辅助SRPP调节橡胶合成，在SRPP表达量不够、橡胶积累不足时起正向调节作用。本项目拟采用分子生物学、蛋白质化学等技术，从橡胶粒子中分离鉴定SRPP，比较机械伤害、茉莉酸和乙烯处理后，SRPP表达规律，开展其结构和功能的初步研究。结果将有助于进一步开展SRPP的功能研究，进而阐明SRPP在橡胶生物合成中的调控方式，为深入理解橡胶生物合成调控机制提供新的理论基础。

橡胶粒子是天然橡胶生物合成的特殊细胞器，REF和SRPP是橡胶离子膜表面含量最大的两种蛋白，普遍认为REF和SRPP参与了橡胶的生物合成过程，但具体作用仍不清楚。在我们的研究中，我们发现巴西橡胶树RY73397胶乳蛋白2-DE分离图谱中至少有33个REF/SRPP蛋白点，多个蛋白点被鉴定为同一蛋白，但我们并不清楚它们是同一种基因的不同翻译后修饰形式，还是序列高度相似的不同基因的翻译产物。为了弄清楚这点，我们搜索整理了NCBI蛋白和核酸数据库中所有的巴西橡胶树REF/SRPP mRNA和蛋白序列，通过比对分析发现巴西橡胶树中一共存在5种不同的REF/SRPP—REF138，REF175，SRPP117，SRPP204和SRPP243。对我们正在研究的巴西橡胶树栽培种RY73397中的REF/SRPP进行了同源克隆，获得了6个REF/SRPP，其中5个与其它栽培种中已发现的REF/SRPP是一致的，而REF258是一个新的REF/SRPP家族成员。比对这6个REF/SRPP的蛋白序列，发现它们分享了相对保守的REF结构域，但它们在REF结构域两侧的N端和C端区域，氨基酸的长度和组成有很大差异，我们推测不同的REF和SRPP差异显著的N端和C端区域可能与它们各自具体的功能相关。然后，我们在巴西橡胶树RY73397基因组中对这6个REF/SRPP基因进行了Southern杂交分析，发现它们在巴西橡胶树RY73397基因组中基本上都是单拷贝，不存在序列相近的同源基因，这个结果说明蛋白2-D胶图中鉴定为同一蛋白的不同蛋白点是同一基因的不同翻译后修饰形式。此外，我们研究了这6个REF/SRPP在拟南芥叶肉原生质体中的定位，发现REF的定位具有一定的趋向性，而SRPP不存在。我们还研究了割胶刺激剂乙烯对REF/SRPP的表达调控，发现这6个REF/SRPP基因的表达基本不受乙烯影响，但同一基因在2-DE中对应的个别蛋白点（不同修饰状态下的REF/SRPP蛋白）的表达丰度在乙烯处理前后存在着明显的变化，这说明乙烯对REF/SRPP的调控不在翻译水平上，而是在转录后修饰水平上。在下一步的研究工作中，我们会鉴定乙烯处理后明显上调和下调的REF/SRPP蛋白点的具体翻译后修饰形式，并比较不同修饰形式的REF/SRPP在橡胶生物合成中的功能差异。