猪源植物乳杆菌在仔猪肠道中的分布和定植研究

仔猪腹泻是养猪业面临的一大难题。乳酸菌已被证实具有调整消化道微生态、提高饲料利用率和改善机体健康状况等益生功能，其中在消化道中定植和粘附是其发挥益生作用的主要基础。但由于无法有效区分内源和外源微生物，因此限制了对其作用机理的深入研究。我们此前从健康仔猪肠道分离到一株有益生作用的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ZLP001），已证实日粮中添加该菌可有效降低仔猪腹泻率、提高日增重，其效果达到饲用金霉素水平。为深入研究这一植物乳杆菌在肠道中的分布规律和定植机制，揭示其抗仔猪腹泻作用的机理，我们拟以绿色荧光蛋白（GFP）基因标记该菌，利用荧光检测技术研究其进入仔猪肠道后的运动与分布规律，采用组织冰冻切片、显微测距技术等研究其粘附定植机制，定位植物乳杆菌在宿主体内的作用部位与方式，以阐明该菌与宿主的共生机理。研究成果也将为更好地理解益生菌作用机理提供新的研究思路和方法。

益生菌制剂饲喂动物后由于不能有效区分其内源性和外源性，从而影响益生菌作用机理的深入研究。本项目利用绿色荧光蛋白（GFP）基因标记了猪源植物乳杆菌ZLP001，通过荧光检测技术对植物乳杆菌ZLP001进入仔猪肠道后的运动和分布规律及粘附定植情况进行了详细的研究。主要研究内容包括三个部分。1）重组菌的构建 将绿色荧光蛋白（GFP）及其表达原件乳酸脱氢酶启动子（PldhL）和嗜酸乳杆菌表面蛋白终止子（TslpA）插入具有红霉素耐药性（Em）和氨苄青霉素耐药性（AmpR）双筛选压力的穿梭表达载体pLEM415，构建GFP标记的穿梭表达载体pLEM415-GFP。利用电转化的方法将穿梭表达载体pLEM415-GFP转化入植物乳杆菌（Lp），获得重组植物乳相菌（Lp-GFP）。重组菌在蓝光激发下可见明显绿色荧光，连续传递10代仍可见明显荧光。2）重组菌生物学特性研究 从最适生长温度、最适初始pH值、生长曲线、人工胃液肠液耐受性、耐高温特性、耐胆盐特性和药敏性等几个方面详细比较研究了Lp-GFP和Lp的生物学特性。结果显示，Lp和Lp-GFP生长曲线的变化趋势基本相同，其中Lp-GFP的生长速度略有滞后；Lp和Lp-GFP和最适培养温度均为37 ℃，最适初始pH均为6.5；Lp和Lp-GFP耐高温、耐人工胃液、人工肠液和耐胆盐的特性趋势一致；Lp和Lp-GFP的抑菌特性无显著差异（P＞0.05）；除了红霉素，Lp和Lp-GFP对其他药物的敏感性基本没有发生变化。结果说明植物乳杆菌的重组对其主要生物学特性没有显著影响。3）重组菌饲喂仔猪试验 仔猪口服接种表达绿色荧光蛋白的植物乳杆菌Lp-GFP后，发现随着接种时间的不同植物乳杆菌在仔猪各肠段肠腔及肠上皮粘膜上的分布和定植情况表现明显的不同。接种1.5-3小时前肠段植物乳杆菌数量较多，后肠段较少；接种6-12小时前肠段植物乳杆菌有所减少，仔猪后肠段植物乳杆菌数量达到峰值；接种24-48小时后各肠段植物乳杆菌数量均表现为持续的降低。结果表明，植物乳杆菌饲喂后6-12小时在仔猪后肠段达到峰值，而且植物乳杆菌大部分存在于肠道食糜中，少部分紧贴于肠上皮粘膜。