不同FMO3基因型产蛋鸡芥子碱代谢差异化机理的研究

Feeding rapeseed meal to laying hens can result in the production of eggs with a fishy odor.Sinapine, the trimethylamine precursors which are present in rapeseed meal, has been reported to cause the production of fishy-tainted eggs in specific FMO3 genotype birds.However, the way of action of sinapine is not fully disclosed. The proposed project is studied from the perspective of difference in sinapine metabolism. Birds with different FMO3 genotype are selected at first, and then we used a dietary sinapine to induce egg tainting. To determine the difference in trimethylamine metabolic steps and related regulatory pathway, trimethylamine production and caecum microflora, microsomal FMO activity and related transcription factors mRNA levels of liver, and trimethylamine deposition among different genotype birds are obverseved.Then, we foucus on FMO3, the enzyme responsible for the oxidation of TMA. We further examine the structure and kinetics of recombinant FMO3 mutant proteins in vitro, in order to investigate the effect of mutuation and sinapine on the enezyme function. From the view of nutrigenetics, the mechanism of sinapine leading to fishy syndrome is illustrated according to the difference in sinapine metabolism among different genotype birds in this proposed project. The current research will provide new approaches to new approaches to reduce the occurrence of fishy tainted eggs, and finally provide the logical proof and technology support for egg flavor improvement and application of rapeseed on poultry feed.

菜籽饼粕因含三甲胺前体物质芥子碱，极易诱发鱼腥味鸡蛋产生。已有研究证实芥子碱致鱼腥味鸡蛋与蛋鸡FMO3基因型有关，但其机理尚不清楚。本项目拟以不同FMO3基因型海兰褐产蛋鸡为试验动物，以芥子碱的差异化代谢为切入点，在建立芥子碱诱发蛋鸡鱼腥味综合征模型基础上，研究不同基因型蛋鸡盲肠三甲胺生成及相关菌群结构的差异、肝脏FMO3酶活及相关转录因子表达的差异，鸡蛋三甲胺沉积的变化规律，确定不同基因型产蛋鸡差异化代谢芥子碱的代谢过程及关键酶调控通路；然后进一步采用体外试验，以三甲胺代谢的唯一有效酶FMO3蛋白为靶心，深入研究体外重组突变FMO3蛋白的酶学结构和代谢动力学参数，探讨突变位点、芥子碱引起酶功能差异的酶学机制，从营养和基因互作角度，阐明不同基因型蛋鸡对芥子碱代谢的差异进而导致鱼腥味综合征的机理，为鱼腥味综合征的研究提供新思路，最终为改善鸡蛋风味、合理使用菜籽饼粕提供科学依据和技术支撑。

鱼腥味综合征系因含黄素单氧化酶3（flavin-containing monooxygenases 3，FMO3）基因突变导致鸡体无法正常代谢三甲胺，使得三甲胺沉积于鸡蛋中，散发出类似鱼臭味的气味。菜籽饼粕因含三甲胺前体物质芥子碱，极易诱发突变个体鱼腥味鸡蛋产生。针对不同FMO3基因型产蛋鸡芥子碱-三甲胺代谢的差异化，本项目首先进行了产蛋鸡FMO3基因型的分离筛选，确定了芥子碱诱发不同基因型产蛋鸡鱼腥味综合征的添加剂量，以易感基因型产蛋鸡建立了芥子碱诱发鱼腥味鸡蛋产生模型，比较分析了日粮芥子碱和菜籽粕对不同基因型产蛋鸡盲肠三甲胺生成、肝脏三甲胺氧化、鸡蛋三甲胺沉积三个关键代谢步骤的影响，体外肝微粒和肝细胞试验分析了突变位点对FMO3酶活性的影响。研究发现：（1）日粮添加7%菜籽粕或0.49%芥子碱可诱发突变基因型个体产鱼腥味鸡蛋，菜籽粕中芥子碱转化为三甲胺在鸡蛋沉积的速度要慢于日粮直接添加芥子碱的转换沉积速度，拟合方程显示菜籽粕水平大于4.62%时，突变基因型个体蛋黄三甲胺达到嗅觉阈值(4 μg/g)；（2）日粮添加芥子碱或菜籽粕改变了盲肠菌群结构，提高厚壁菌-拟杆菌的比例，促进三甲胺的生成，厚壁菌门和变形菌门及其中的一些微生物属为主要的三甲胺产生菌；（3）在基因表达水平上，与FMO3正相关的基因主要参与酶代谢功能，而负相关的基因主要参与基因表达调控过程，进一步研究发现，肠道微生物的三甲胺代谢途径调控了宿主脂质代谢，FMO3是该途径的关键结点；（4）突变个体酶活性降低，可能因T329S位点突变引起FATGY基序中亲水性氨基酸的改变，不利于酶与辅因子FAD和NADPH的结合。综上，突变导致酶活性的下降是造成基因型间三甲胺代谢差异的主要原因；添加芥子碱或菜籽粕改变了盲肠菌群结构，增加了三甲胺的产生，加剧了突变个体三甲胺代谢的负担；FMO3介导的三甲胺代谢通路还参与调控宿主脂质代谢。上述研究结果可为菜籽饼粕的合理应用和鸡蛋风味的改善提供科学依据和实践指导，为解析微生物及宿主代谢之间可能的通话机制提供了方法学借鉴。