猪乳exosome对仔猪肠道PEDV病毒的抑制作用及其机制研究

China is a large pig raising country. The health of intestine is the key factor for pig breeding. Porcine epizootic diarrhea is closely related to piglet intestinal health, which can lead to the fatality rate up to 100%. The disease has no specific treatment at present and relies on comprehensive prevention. Breast milk plays a capital role during the prevention process. For the past few years, many researchers reported that breast milk is abundant of exosomes, which can transfer functional molecules to different cells and tissues. However, their mechanism remains controversy. Up to now, there is still no report about the effects of milk exosomes on PEDV. Earlier, our group found that the porcine milk could inhibit the PEDV on intestinal cells, but the mechanism had not been revealed. Therefore, this program will investigate the regulatory mechanism of porcine milk on PEDV via the morphology, molecular biology and tracing methods in vitro and in vivo, which will provide new references of breast milk on enhancing the resistance of PEDV in piglets, improving survival rate and piglets’ intestinal health, and also provide new ideas and approaches for the research on mother-to-child integration and healthy breeding.

我国是养猪大国，仔猪肠道健康是生猪养殖的重要环节，猪流行性腹泻（PED）与仔猪肠道健康密切相关，对仔猪的病死率可达100%，该病目前尚无特效治疗药物，主要以综合防治为主，在预防过程中，母乳起着关键的作用。近年来，在母乳中发现存在大量的exosome，可在不同的细胞或组织间传递活性功能性物质，并调控靶组织或器官，但其作用机制和方式仍存在争议，然而迄今，仍未见乳exosome作用于PEDV的报道。本课题组前期发现，猪乳exosome对肠细胞感染PEDV具有抑制作用，但其作用机制及方式仍未揭示。因此，本项目拟通过体内和体外研究方法，运用形态学、分子生物学、细胞生物学和示踪检测等相关技术，深入探讨猪乳exosome抵抗仔猪肠道PEDV的调节机制，为揭示母乳成分增强仔猪对流行性腹泻抵抗力、提高仔猪成活率、改善仔猪肠道健康提供新的参考依据，同时为母子一体化研究和健康养殖提供新的思路和途径。

本项目主要研究猪乳外泌体（exosome）对仔猪肠道感染PEDV的抑制作用及机制，项目首先在不同细胞（悬浮和贴壁细胞）上验证了猪乳exosome对PEDV的抑制作用及细胞表型，并进一步确定其作用浓度和作用方式，随后细胞水平进行机制探索，最后在活体上确认效果及机制验证。具体结果如下：.1、.猪乳exosome在IPEC-J2细胞感染PEDV后能显著提高细胞活力和数量（P<0.01），且exosome和PEDV的作用浓度范围分别在1~2×10^9和0.01~0.1 MOI之间；.2、.将exosome以预防、杀灭和修复三种方式分别处理感染PEDV后的IPEC-J2细胞，结果显示，三种方式均极显著抑制细胞及细胞上清中病毒相关 M\N\S ORF\RNA聚合酶基因的表达（P<0.01），且杀灭和修复两种方式显著促进细胞数量和活力（P<0.01）；.3、.细胞分子水平检测结果显示，猪乳exosome可显著影响IPEC-J2细胞中pAPN、IFN-a、IRF3、PCNA、cyclin D1、ZO-1、Claudin 1的表达水平（P<0.05），蛋白检测结果显示，猪乳exosome能抑制病毒N蛋白及细胞凋亡CLDN1蛋白的表达；.4、.活体实验结果表明，猪乳exosome可减少PEDV感染下的仔猪腹泻率和死亡率，缓解PEDV对仔猪肠道的损伤，并且显著抑制病毒M\N\S ORF\RNA聚合酶基因在肠道的表达（P<0.01），同时显著降低病毒N蛋白表达水平（P<0.05）；.5、.进一步机制验证显示，抑制PEDV在肠道内的成分为猪乳exosome miRNAs成分，且miR-let-7e和miR-27b分别通过调节其相应靶基因病毒N蛋白及细胞HMGB1基因的表达协同发挥实现抑制PEDV对肠道细胞的损伤作用;.6、.肠道类器官组织培养探索结果显示，猪乳exosome能促进类器官的增殖。.以上结果证明，猪乳exosome能够抑制PEDV在仔猪肠道细胞的增殖，其作用方式可能为杀灭和修复，其作用途径一方面为通过提高细胞增殖、免疫及肠道屏障相关基因水平，抑制凋亡、炎症相关因子的水平，另一方面通过抑制病毒本身基因和蛋白的表达水平，从而达到抵抗病毒的作用，且猪乳exosome中发挥作用的成分为miRNA组分，各成分之间可通过协同作用的方式抑制PEDV对肠道细胞的感染。