德氏乳杆菌缓解断奶仔猪肠道屏障氧化损伤机制研究

Piglets are readily subjected to various factors, causing host oxidative stress, dysfunction of intestinal barrier function, and finally resultant lower growth performance in pig industry. How to maintain intestinal health is a key problem in modern pork production. This study aimed to evaluate lactobacillus delbrueckii ameliorate oxidative stress mediated intestinal barrier disorder in piglets through analyzing oxidive and anti-oxidative parameters in serum, intestinal mucosa and IPEC-J2, intestinal permeability and trans-epithelium electrical resistant (TER) and tight junction proteins expression and distribution in intestine and IPEC-J2 by using enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA), immunohistochemical techniques, real-time PCR, confocal fluorescent microscope, ussing chamber, and western blot. Using Btk and Nrf-2 specific inhibitors and RNA interference technique to knock-down TLRs, Btk, Nrf-2 expression investigate the role of TLR-Btk-Nrf-2 signaling pathway in modulating intestinal redox homeostasis and barrier function, unveiling the mechanism of lact delbrueckii alleviate intestinal barrier oxidative damage, which form the theoretical basis for the development of lact delbrueckii-based probiotic and its application in the livestock production.

在规模化养殖过程中，仔猪很容易受到许多因素的影响，引起机体氧化应激，导致肠道屏障氧化损伤，生长性能降低。如何维持仔猪肠道健康已成为现代生猪生产的难题。本研究应用ELISA、免疫组织化学、实时荧光定量PCR、细胞流式术、激光共聚焦显微镜技术、ussing chamber和蛋白印迹等技术考察仔猪血清、肠道粘膜以及IPEC-J2氧化与抗氧化相关指标，并分析肠道和IPEC-J2的通透性和TER以及紧密连接蛋白的表达与分布，考察德氏乳杆菌缓解氧化应激介导肠道屏障功能损伤；采用Btk和Nrf-2抑制剂，以及RNA干扰技术敲除IPEC-J2中TLRs、Btk、Nrf-2的表达，考察TLR-Btk-Nrf-2信号通路在调控肠道氧化还原平衡和肠道屏障功能中的作用，揭示德氏乳杆菌缓解仔猪肠道屏障氧化损伤作用机制，为乳酸菌制剂的开发和在畜牧生产中应用提供理论依据。

仔猪早期断奶是现代集约化养猪业的关键技术之一。然而由于断奶过程中，仔猪环境和饲料的变化造成仔猪断奶应激。断奶应激不仅可能会引起肠道炎症，还会由于自由基代谢紊乱和氧化系统的破坏，从而导致肠道的氧化损伤，生长性能降低。本试验采用脂多糖（Escherichiacoli‍ O55:B5，LPS）诱导的断奶仔猪氧化应激动物模型的体内试验和H2O2诱导的猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）氧化应激模型的体外试验，探讨了德氏乳杆菌（Lactobacillus‍ del‍brueckii，LAB）缓解断奶仔猪肠道屏障氧化损伤的保护作用及其分子机制。. 选取胎次和体重相近（7.14±0.16kg）、健康的36头25日龄断奶的三元杂交仔猪（杜洛克×长白猪×大约克夏）随机分为3个处理组，每个处理6个重复，每个重复2头仔猪。试验分组如下：对照组（CON，饲喂基础日粮）；LPS模型组（LPS，饲喂基础日粮）；德氏乳杆菌组（LAB+LPS，饲喂基础日粮中添加0.2%的LAB）。试验期28d，在试验的第29d上午八点，LPS和LAB+LPS组分别以体重（BW）为计量单位，在仔猪腹腔注射100 μg/kg‍ BW LPS，对照组注射相同剂量的生理盐水。选取IPEC-J2细胞作为研究对象，建立H2O2诱导 IPEC-J2 细胞氧化损伤模型。利用特异性 TLRs 抑制剂、Btk抑制剂和Nrf2抑制剂靶向阻断Nrf2信号通路等方法，研究 LAB缓解H2O2对IPEC-J2细胞屏障氧化损伤的作用机制。研究表明，仔猪肠道氧化损伤，引起多种基因和蛋白的变化，从而导致肠道结构和功能的破坏。日粮中添加LAB可以改善仔猪肠道氧化损伤的形态结构，增强肠道紧密连接蛋白的表达来改善氧化受损的仔猪肠道屏障功能。本试验也证明了肠道微生物是LAB发挥抗氧化作用的重要靶标。日粮中添加LAB改变的肠道微生物中特定菌群（如增加乳酸杆菌丰度，减少链球菌的丰度等），从而缓解LPS应激引起的仔猪肠道氧化损伤。通过体外细胞试验研究表明明LAB可以通过激活TLRs-Btk-Akt-Nrf2信号通路，调控IPEC-J2细胞抗氧化酶和紧密连接蛋白的表达，从而缓解氧化应激导致的肠道屏障的损伤。