蛋白酶在复杂纤维小体调控中的作用机制研究

Cellulosome is a multi-enzyme complex that can degrade the lignocellulosic resource effectively, with a dynamic and substrate-mediated regulation mechanism. New type Sigma/Anti-sigma factor SigI/RsgI is the main regulation system of the intricate cellulosome. The transmembrane RsgI transmits the extracellular substrate signal to the corresponding intracellular SigI to activate it, and then initiate the transcription of the relevant cellulosomal genes. Our previous studies indicated that proteases are involved in the transmembrane signal transduction of RsgI in the intricate cellulosome regulation system of Clostridium thermocellum, however, the specific way of this mechanism is not clear. In order to resolve this new type protease-mediated signal transduction mechanism, the methods of co-immunoprecipitation and gene knock-out will be used to screen and identify the proteases which are involved in the signal transduction of C. thermocellum RsgI in this project. Furthermore, the targets of the enzymes, the key sites and the enzyme-digested order will be determined by using the methods of gene overexpression technique of C. thermocellum, western-blot, protein sequencing, site-directed mutagenesis and so on, and finally the protease-mediated signal transduction model of RsgI will be constructed. Through elucidating the specific mechanism of the proteases in the regulation system of the intricate cellulosome, this study will provide a significant basis for better understanding of the efficient substrate degradation mechanism of the cellulosome and its application in the biomass conversion.

纤维小体是一种可高效降解木质纤维素的多酶复合体，具有底物偶联的动态调控机制。新型的σ/Anti-σ因子SigI/RsgI是复杂纤维小体主要的调控系统，通过RsgI将胞外底物信号跨膜传递给胞内的SigI并使其激活，从而起始纤维小体相关基因的转录。我们的前期研究表明，在热纤梭菌的复杂纤维小体调控系统中，蛋白酶参与了RsgI的跨膜信号传导过程，但是具体酶切机制尚不清楚。为了解析这一新型的蛋白酶偶联的调控信号传导机制，本项目将利用免疫共沉淀和基因敲除等方法筛选和鉴定参与热纤梭菌RsgI信号传导的蛋白酶，并进一步通过热纤梭菌基因过表达技术、免疫印迹、蛋白测序和定点突变等方法确定RsgI的各酶切靶点，关键作用位点及蛋白酶的作用顺序，建立蛋白酶偶联的RsgI信号传导模型。本研究对蛋白酶在复杂纤维小体调控系统中的具体作用机制的阐明，将为深入理解纤维小体的高效底物降解机制及其在生物质转化中的应用奠定基础。

纤维小体是一种可高效降解木质纤维素的多酶复合体，具有底物偶联的动态调控机制。新型的σ/Anti-σ因子SigI/RsgI是复杂纤维小体主要的调控系统，通过RsgI将胞外底物信号跨膜传递给胞内的SigI并使其激活，从而起始纤维小体相关基因的转录，但是RsgI的具体信号传导机制却并不清楚。通过本项目的研究，我们发现热纤梭菌RsgI利用一种特殊的酶切机制来传递信号以调控纤维小体基因的转录。首先，利用遗传操作、免疫印迹、Cell-free表达和蛋白测序等方法，确定RsgI总是在周质空间结构域的保守的Asn-Pro位点发生自酶切现象。随后，通过对RsgI6的敲除及回补突变株的表型分析确定该自酶切是起始RsgI信号传导的第一步，并通过对RsgI周质空间结构域的结构解析及定点突变分析获得RsgI自酶切的机制，最后利用RsgI6和蛋白酶双敲菌株及回补鉴定到传统的第二步蛋白酶RseP主导了RsgI的下一步信号传导，最终解析了RsgI具体的信号传导机制：RsgI周质空间多个保守的氨基酸导致RsgI发生自我酶切，当RsgI胞外区感知并结合底物后，RsgI在自酶切位点处发生分离，其跨膜和胞内部分逐步被RseP和胞质蛋白酶识别和降解，从而释放并激活SigI以起始纤维小体基因的转录。此外，我们还发现膜蛋白酶DegP和纤维小体蛋白酶Clo1313_0689也能够参与纤维小体表达和组装的调控。RsgI信号传导机制的解析及可调控纤维小体蛋白酶的发现，能够使我们深入的了解复杂纤维小体的表达调控方式，并为后续热纤梭菌和纤维小体的理性改造和定制提供材料，为加速其工业应用奠定基础。此外，RsgI这种特殊酶切信号传导机制的发现进一步完善了Anti-σ因子的信号感应和传递机制，为细菌中跨膜信号传导机制的研究提供重要参考。