利用Nanopore测序技术绘制细菌磷硫酰化修饰的基因组图谱

DNA phosphorothioation (PT) was a newly identified physiological modification in the DNA backbone, in which the nonbridging oxygen in the sugar-phosphate backbone is replaced by sulfur. Because of the unusual features of PT modification, chasing for its biological function has become the hotspot with challenges. On one hand, PT modification can act as a restriction-modification (R-M) system to protect the host from the invasion by the foreign DNA, on the other hand, PT modifications are involved in the epigenetic regulation and maintenance of cellular redox homeostasis. Here we set out to locate PT sites through the bacterial genome with the new generation sequencing technology, Nanopore sequencing technology, to avoid the problem of poor signal abundance from SMRT sequencing. With this genomic map of PT modification, we will figure out the distribution of this modification, enabling us to explore the biological function of this unusual modification.

DNA磷硫酰化修饰是近年发现的，第一例天然存在于DNA骨架上的新型修饰。其化学本质是DNA磷酸二酯键的非桥连氧原子被硫原子取代，拓展了DNA的元素组成。自从修饰的化学本质被揭示以来，因其修饰的特殊性，对其修饰特征、生理功能的研究便一直是本领域的研究重点。一方面，磷硫酰化修饰能作为限制-修饰系统组成细菌的防御体系，另一方面，磷硫酰化修饰展现出其表观遗传调控、参与维持细胞内氧化-还原平衡的能力。本项目拟对磷硫酰化位点进行小分子特异性标记，并利用新一代测序技术--Nanopore测序技术，以克服单分子实时SMRT测序中，磷硫酰化修饰信号弱的缺陷，对磷硫酰化修饰在细菌基因组水平分布进行更精确的定位，更精准地绘制出其修饰的细菌基因组图谱，找到其在细菌基因组上的更准确的分布特征，以帮助我们更深入地挖掘磷硫酰化修饰的潜在生理功能。

DNA磷硫酰化修饰是第一例被发现天然存在于DNA骨架上的修饰结构。在前期的研究中，我们鉴定了其修饰核心基序和修饰频率，并以SMRT测序技术，在基因组水平上初步定为了其修饰位点，发现DNA磷硫酰化修饰具有部分的、随机的和动态的修饰特征。但是我们发现，在SMRT测序技术中，基于DNA聚合酶链式反应释放的荧光信号间的时间差来检测DNA磷硫酰化修饰的方法，其分辨率较低，其可能导致我们所解析的DNA磷硫酰化修饰图谱失真。为了解决这一问题，我们在本项目中，采用了技术原理完全不同的Nanopore测序技术，期望通过DNA磷硫酰化修饰的在Nanopore测序中带来的电流变化，来定位基因组的DNA磷硫酰化修饰位点。. 基于以上想法，我们提取了Salmonlla enterica servor Cerro 87及其dnd基因簇突变株XTG103的基因组DNA，进行了Nanopore测序，通过提取测序数据中5'-GAAC-3'和'5-GTTC-3'潜在修饰基序的电流信号，我们发现Nanopore测序数据完全覆盖了整个S. enterica serovar Cerro 87的所有5'-GAAC/GTTC-3'位点，但是通过其中有差异的信号比理论值明显偏少，这提示我们，仅仅采用无化学标记的基因组，Nanopore测序对于DNA磷硫酰化修饰的分辨率不足。. 为了解决这个问题，我们开发了针对DNA磷硫酰化修饰的小分子特异性标记的方法，通过碘乙酰胺，将含有DNA磷硫酰化修饰的基因组进行化学标记，在质检合格后，进行了Nanopore测序和SMRT测序，但是结果显示，标记后的DNA，虽然完整性完好，但是其在Nanopore测序或者SMRT测序的过程中，产出的数据量异常，可能是因为化学修饰的DNA影响了测序反应造成的。. 最后，我们对化学标记DNA磷硫酰化修饰的方法进行了进一步研究，开发了一套单分子检测DNA磷硫酰化修饰的体外检测方法，发现了DNA磷硫酰化修饰在不同细菌个体中存在异质性，这为我们进一步了解DNA磷硫酰化修饰的生理学功能打下了基础。