碳代谢抑制作用调控纤维小体表达的分子机制研究

The absence of low-cost, high-efficient technology for overcoming the recalcitrance of cellulose has become recognized as the major bottlenect in utilizing cellulosic biomass as a resource for production of renewable, clean energy. Anaerobic and cellulolytic microorganisms digest cellulose very efficiently via an enzymatic complex called the cellulosome, which represents a major paradigm for efficient biological degradation of cellulosic biomass. However, less is known about the regulation mechanism of cellulosomal expression. Thus， it is difficult to engineer high cellulosome-producing microorganisms for industrial production because of the absence of effective targets. .The findings of carbon catabolic repression (CCR) regulating potentially expression of cellulosome in Clostridium cellulolyticum has been detected via genomic comparison and the transcription porfile under various carbon sources in our lab. Here we proposed a project to reveal the molecular mechanism of CCR regulating the expression of cellulosome and co-regulatory network of cellulosome with other metabolic pathway via biology techniques, such as comparative genomics, genetic engineering of microorganism, interaction of bilogical macromolecules and proteomics, in which two scientific issues are raised, the identification of CCR regulators and its bind sites in cellulosomal genes. The results in the project will help us to understand the molecular mechanism of CCR regulating the expression of cellulosome, and lay the groundwork for the construction of cell factory to efficiently converse cellulose into biofuels.

纤维小体是厌氧纤维素降解菌分泌的一类高效降解木质纤维素的多酶复合物。目前由于缺乏对纤维小体表达调控机制的研究，还无法通过有效的遗传改造方法获得适用于大规模工业生产的高效且底物特异性的纤维小体生产菌株。.项目组通过对Clostridium cellulolyticum不同碳源下的全基因组转录图谱进行比较，发现其纤维小体的表达潜在受到细菌碳代谢抑制作用(CCR)的调控。在此研究基础上，本项目将针对"调控纤维小体表达的CCR相关调控因子的发现"及其"作用位点的确定"两个关键科学问题，运用比较基因组学、微生物遗传操作、大分子相互作用、蛋白质组学等生物技术手段，分别从计算预测、体内和体外实验验证等三个方面，深入研究CCR相关调控因子调控纤维小体表达的分子机制，并根据这些调控因子作用靶点的规律，挖掘与纤维小体共调控的其他代谢途径，为进一步构建能够实现高效纤维素转化的细胞工厂奠定基础。

木质纤维素是地球上最丰富的生物大分子，是可用于生产清洁能源的可再生资源之一。以解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum为代表的一类厌氧革兰氏阳性梭菌，进化了一种高效降解木质纤维素的超分子多蛋白亚基的纤维素酶复合体—纤维小体（Cellulosome）。但是，由于缺乏对其表达调控机制的认识，限制了人们对这类细菌进行有效的遗传改造，以克服其产量过低的工业化应用瓶颈。本项目以C. cellulolyticum为研究体系对纤维小体表达调控机制进行了深入研究。首先，通过不同碳源下的全基因组水平转录图谱比较分析，纤维素酶基因根据其转录模式的不同，可以分为降解纤维素的“主酶”和降解非纤维素的“辅酶”。其次，通过生物信息学方法和基因突变分析，发现“主酶”受到碳代谢抑制作用机制（CCR）的调控；而“辅酶”表达具有底物特异性，受到双组份信号转导系统（TCS）的调控。并在此基础上，分离和鉴定了一系列内源性强组成型启动子和诱导型启动子。最后，基于差异RNA测序技术（dRNA-seq）发现编码纤维小体关键基因簇cip-cel中各个基因的差异表达是通过选择性RNA剪切保护机制（SRPS）精确控制的。总之，通过本项目的实施，在广度（基因组水平）和深度（单个基因簇）上全面系统地解析了纤维小体表达调控机理。本项目研究成果不仅为人工纤维小体的体外装配和体内优化提供了设计思路和改造靶点，同时为控制多基因表达的合成生物学工具开发提供理论依据和元件。