通过人工纤维小体的体内构建研究纤维小体与梭菌细胞的协同作用机制

Renewable energy produced from lignocellulose is emergently needed recently. Cellulosome is considered as one of the most efficient microbial strategies for lignocellulose degradation, and it is important to understand degrading mechanism behind. It is well known that the enzyme-microbe synergy is an important factor stimulating the activity of cellulosome in lignocellulose degradation. In order to deeply understand this synergetic effect, a novel strategy of designer cellulosome in vivo construction using CipC-inactivated Clostridium cellulolyticum H10 mutant as chassis is employed in this study. Different patterns of cellulosome-cell wall attachment are chosen to compare the cellulose degrading activity of in vivo and in vitro designer cellulosomes, and the synergy mechanism will be therefore revealed. Based on obtained knowledge, the composition and structure of designer cellulosome will be optimized, and a new designer cellulosome with higher cellulose/straw degrading activity will be thereafter designed and constructed in H10 chassis. Thus, an engineered C. cellulolyticum strain with reconstructed cellulosome will be obtained, which will show higher efficiency in lignocellulose degradation than the wild type strain. This study provides a novel thought and experience for the use of designer cellulosome in synthetic biology, and can also promote the bio-transformation of lignocellulose via consolidated bioprocessing.

以木质纤维素为原料的可再生能源是当今世界迫切需要的能源替代品。纤维小体是公认的最高效的微生物降解木质纤维素的策略之一。因此，研究纤维小体的高效作用机制对木质纤维素的生物转化具有重要意义。已知在木质纤维素降解过程中存在细胞与纤维小体的协同作用，对纤维小体发挥高效性非常重要。为深入研究纤维小体与细胞的协同作用机制，本项目采用以脚架蛋白CipC靶向敲除的解纤维梭菌为底盘细胞的体内策略构建人工纤维小体，通过选择不同的细胞壁结合模式，比较人工纤维小体在体内与体外环境下降解纤维素的效率，分析纤维小体与细胞相互作用的关键因素；根据获得的协同机制认识，优化人工纤维小体组成并改造协同作用因子，提高人工纤维小体的活性；通过在解纤维梭菌底盘细胞内重建优化的人工纤维小体，获得木质纤维素降解效率优于野生株的重组菌株。本研究将为人工纤维小体在合成生物学上的应用及通过整合生物加工实现木质纤维素转化提供新思路和实践经验。

纤维小体是公认的最高效的微生物降解木质纤维素的策略之一。因此，研究纤维小体的高效作用机制对木质纤维素的生物转化具有重要意义。已知在木质纤维素降解过程中存在细胞与纤维小体的协同作用，对纤维小体发挥高效性非常重要。通过本项目的研究，我们开发了高温梭菌的无疤基因组编辑技术以及新型的梭菌可控基因操作系统，可以实现基因的靶向敲除和可控表达，从而进一步建立并完善了梭菌的遗传改造平台。利用上述工具，我们构建了八株热纤梭菌的纤维小体脚架蛋白突变菌株，通过多水平定性定量分析，发现脚架蛋白中不同的功能模块对促进纤维素降解的贡献各不相同，其中CohI及CBM模块是决定纤维小体高效性的关键模块，XDocII结构是“纤维小体凸起”结构形成的决定因素，二级脚架中CohII数量越多越有利于纤维素降解，而细胞与底物的相互作用不依赖于纤维小体，从而系统阐明了纤维小体中存在多级协同效应。即，酶与酶以及酶与底物之间的协同作用为核心机制，酶与细胞之间的协同作用为辅助机制。此外，我们还对热纤梭菌纤维小体中的类膨胀因子等非酶元件的功能及其在纤维素降解过程中与纤维素酶的协同作用进行了分析，表明纤维小体类膨胀因子可能具有促进木质纤维素降解的作用。根据对协同机制的认识，我们还对纤维小体中关键的纤维素酶Cel48S进行定向改良，通过引入葡萄糖苷酶，增加其与CelS的协同反应，降低纤维二糖对纤维小体的反馈抑制作用，从而显著促进纤维素的水解效率，提高还原糖的生产水平。