VSV G病毒融合蛋白的作用机制研究

Membrane fusion is an important biological process involved in normal and pathological cellular activity such as hormones or neurotransmitters release, nutrient uptake, and the virus infection. SNARE proteins are membrane fusion machinery which drives the fusion of vesicles and the target membrane in the cell. A fundamental question is "how many SNARE proteins could drive single fusion event?" To answer this question, a novel in vitro fusion system, lipsome-nanodisc fusion assay was developed. Using this assay, I found single SNARE complexes is sufficient to fuse the bilayer, but at least 3 SNARE complexes are needed for fast and effective release of soluble content. Similar to SNARE proteins, virus fusion proteins could drive the fusion of virus envelope with cellular membranes by some common process and mechanism. In this study, we will utilize in vitro fusion system to study how virus fusion proteins drive membrane fusion. As a classic model of type III virus fusion protein, VSV G proteins undergo dramatic conformation changes before and after fusion, energy produced in this process could overcome the energy barrier of membrane fusion. Based on the structural information of pre- and post-fusion state, we will determine the key domain or residues of VSV G protein that are essential to drive the membrane fusion. By loss-of-function mutants screening, we could unravel the connection between protein structure and its function. Finally, by lentivirus infection assay in cells or model animals, we could confirm above results in vivo, and reveal the membrane fusion mechanism mediated by VSV G protein. This study will greatly enrich our understanding on virus fusion mechanism, and provide important clues to prevent virus infection and develop new therapeutic methods.

膜融合涉及许多重要的细胞生理和病理过程，例如激素及神经递质释放、营养物摄取、病毒侵染等。SNARE蛋白是介导细胞囊泡融合的蛋白，申请人利用新颖的体外膜融合平台，回答了"单次融合需要几个SNARE蛋白驱动"这一重要科学问题，结果表明单个SNARE复合物可以介导膜融合，但需要至少3个SNARE复合物协同作用才能快速释放囊泡内容物。病毒融合蛋白与SNARE蛋白介导的膜融合具有相似的机制和进程。本研究将利用体外膜融合平台，以水疱口炎病毒（VSV）G蛋白为模型，研究病毒融合蛋白如何介导病毒侵染细胞。通过对比VSV G蛋白在融合前后不同的蛋白构象，确定关键结构域和氨基酸位点，筛选功能缺失突变体，并利用VSV G蛋白制备慢病毒进行细胞、动物侵染等体内实验，从而研究其结构与功能的联系，揭示其介导的膜融合分子机制。本研究将促进我们对病毒融合蛋白介导的膜融合机制的认识，为预防和治疗病毒相关疾病提供相应的理论。

病毒融合蛋白能够介导病毒囊膜与宿主细胞的膜发生融合，这是病毒侵染宿主的关键步骤之一。在本研究中，我们探索了水泡性口炎病毒G蛋白介导的膜融合机制。VSV G蛋白是III型病毒融合蛋白的代表。它在酸性条件的刺激下，能够介导膜融合。为了研究VSV G蛋白介导的膜融合机制，我们建立了由VSV G蛋白介导的细胞融合系统，两种细胞被不同颜色的荧光标记，在酸性条件刺激下，可以发生细胞融合。利用这个系统，我们对细胞融合进行实时观测和定量分析，发现VSV G能够快速（1-2分钟）并有效的介导细胞融合。我们进一步研究了VSV G蛋白跨膜区在膜融合中的功能。我们将VSV G的跨膜区用其他膜融合蛋白的跨膜区取代，包括介导囊泡融合的SNARE蛋白的跨膜区以及I型病毒融合蛋白流感病毒的HA蛋白。在VSV G蛋白跨膜区被取代后，VSV G介导的细胞融合效率显著下降，并且其介导的慢病毒和水泡性口炎病毒的感染效率也显著降低。研究发现VSV G蛋白跨膜区在从膜融合中间态的半融合阶段过渡到完全融合阶段具有重要作用。我们还鉴定了位于跨膜区的一些重要的氨基酸位点。该研究表明，作为作用于脂膜的力学元件，病毒融合蛋白和其他融合蛋白的跨膜区都是非常重要的。但这些跨膜区并不是等同的，他们互相替换后会损害膜融合蛋白介导膜融合的能力。上述结果已经发表在Scientific reports上..研究中，我们发现利用突变的VSV G蛋白制备的重组水泡性口炎病毒具有较低的感染效率，具备发展成为水泡性口炎病毒减毒疫苗的潜能。水泡性口炎病毒对于牲畜具有较大的危害，目前尚无疫苗或药物进行预防和治疗。因此，我们总结了利用突变的VSV G蛋白制备水泡性病毒的方法，并申请了减毒疫苗的专利，目前在审核中。