线粒体分裂蛋白Drp1在颗粒酶F诱导细胞死亡过程中的功能研究

CTL and NK cells are important effector cells for our body when clearing virus-infected cells and tumor cells. CTL and NK cells kill target cells via Granzyme pathway. Granzyme F is one of the important members. It is specifically expressed in NK cells. It is found that Granzyme F may play an important role in tumor clearing by Gene "knock out" study in mice. Our previous study confirms that Granzyme F induces cell death through a novel pathway: the death is independent of Bax/Bak. It have been reported that Bax/Bak deletion or gene mutations of tumor cells are resist to chemotherapy drugs. The Bax/Bak-independent pathway become more and more important. We found that Granzyme F can not directly cause mitochondria damage.We proposed that there must be some unknown intracellular factors. We identified mitochondrial fission related protein Drp1 as a potential substrate, and confimed it by cleavage assay. On this basis, we will further study the molecular mechanism of Granzyme F-induced Bax/Bak-independent cell death. How does Drp1 or its cleaved form regulate or affect the death process. It will help us to understand the anti-tumor effect of NK cell, and to provide more information for Bax/Bak-independent apoptosis studies.

CTL和NK细胞是机体清除病毒感染细胞和肿瘤细胞的重要效应细胞，它们主要通过颗粒酶途径杀伤靶细胞。颗粒酶F是其中一个重要成员，它特异表达于NK细胞，对基因敲除小鼠的研究发现颗粒酶F可能在肿瘤清除过程中起重要作用。我们的研究证实颗粒酶F能通过一条独特的途径诱导Bax/Bak非依赖细胞死亡，但确切的分子机制尚未阐明。有报道Bax/Bak缺失或基因突变的肿瘤细胞对大多化疗药物不敏感，因此Bax/Bak非依赖通路的研究逐渐引起关注。我们发现颗粒酶F不能直接作用于线粒体，而是通过未知胞内分子引起线粒体破坏。通过亲和柱层析鉴定得到线粒体分裂相关蛋白Drp1，实验证实Drp1是颗粒酶F的底物。在此基础上，我们将进一步研究颗粒酶F诱导Bax/Bak非依赖细胞死亡的机制，探讨Drp1被切割后是如何调控或影响死亡的进程，以期更深入了解NK细胞抗肿瘤作用的机制，并为Bax/Bak非依赖凋亡通路的研究提供借鉴。

肿瘤已成为危害人类健康最重要的疾病之一，机体的免疫系统是对抗早期肿瘤生成的第一道防线，其中，NK细胞通过颗粒酶杀伤的免疫监视机制起着至关重要的作用。本研究以颗粒酶F为研究对象，探讨其引起靶细胞凋亡的机制。.小鼠颗粒酶家族共有11个成员，相似性较高，位于同一个基因座位，我们推测这些基因应该具有冗余或互补的作用。我们首先通过实时定量定量PCR方法检测，发现颗粒酶F表达于类NK细胞的LAK细胞中，提示我们颗粒酶F可能在NK抗肿瘤中起着重要作用。我们进一步通过不同表达体系的摸索，优化表达了重组小鼠颗粒酶F蛋白，通过LDH释放、电镜、TUNEL染色荧光显微镜和流式细胞仪分析等多种方法，深入探索了颗粒酶F诱导细胞凋亡的机制。并且我们通过分离单独的线粒体，处理发现颗粒酶F不能直接作用线粒体，而是通过别的底物发挥作用。通过亲和柱层析，分离鉴定得到十几个可能与颗粒酶F相互作用的蛋白，其中我们认为Drp1可能是一个比较重要的胞内底物。我们通过颗粒酶F处理细胞裂解液，WB检测发现Drp1被切割，并产生约60kDa的切割片段。我们利用复制缺陷型腺病毒，建立重组颗粒酶F转导体系，进一步证明在模拟生理情况下，Drp1是颗粒酶F的作用底物。我们通过构建Drp1真核表达载体，获得Drp1高表达的肿瘤细胞，颗粒酶F处理之后，检测发现Drp1有效抑制了颗粒酶F诱导的凋亡，证明Drp1参与了颗粒酶F介导的细胞凋亡途径，并起着重要作用。此外，在本项目部分资助下，我们还通过数据库挖掘、临床病人样本分析等方法，开展了原发性肝癌指纹谱的研究，鉴定发现了几个重要的癌症相关基因。.本研究鉴定了颗粒酶F的作用底物Drp1，并进一步验证Drp1影响颗粒酶F介导的细胞凋亡，为进一步阐明颗粒酶F的作用通路提供了重要思路，加深了我们对NK细胞抗肿瘤作用的分子机制的认识。