苦参甘草组方协同改善内质网钙平衡治疗非酒精性脂肪肝的分子机制研究

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a common clinical disease in China, eventually can lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma, and lack of effective treatment medicine. The main pathological features are: endoplasmic reticulum stress, mitochondrial damage, liver fatty degeneration and nonspecific inflammatory reaction. Recent research indicates that the endoplasmic reticulum calcium homeostasis, especially endoplasmic reticulum calcium ions release and reuptake which mediated by IP3R and SERCA, play a critical role in the pathogenesis of NAFLD. Recently, we found the Sophorae flavescentis-Glycyrrhiza uralensis Fisch prescription (SGP) can prevent liver fatty-degeneration, restoring mitochondrial ATP levels and regulated the endoplasmic reticulum calcium of NAFLD mice model. But the molecular mechanism is unknown. By using human liver L02 cell line and siRNA interference technology, this topic will study on the release and re-intake bidirectional regulation effect on endoplasmic reticulum calcium ion by SGP; To study the inhibition of endoplasmic reticulum stress, the inflammatory reaction; recovery the mitochondria function by SGP, using the mitochondrial membrane potential methods of determination and oxidative phosphorylation of the chromatographic analysis; This study will reveal the function of NAFLD treatment by SGP. Provide the experimental basis for the clinical treatment of NAFLD, and also provide new way for the modernization of traditional Chinese medicine prescription.

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是我国临床常见病和多发病，最终可导致肝硬化及肝细胞肝癌，目前缺乏有效治疗药物。其主要病理特征是：内质网应激、线粒体损伤、肝脏脂肪样变性和非特异性炎性反应。近年研究表明，内质网钙平衡，尤其是IP3R和SERCA介导的内质网钙离子释放与再摄入平衡失调，在NAFLD的发病中起至关重要的作用。最近，我们发现苦参甘草组方可防治NAFLD模型小鼠肝脏脂肪样变性，恢复线粒体ATP水平并影响内质网钙离子调节，但分子机理不详。本课题拟采用人L02肝细胞系及siRNA干扰等技术，研究苦参甘草组方对内质网钙离子释放与再摄入的双向调节作用；采用线粒体膜电位测定及氧化磷酸化色谱分析等方法，研究苦参甘草组方抑制内质网应激，改善线粒体功能及肝脏炎性反应的分子机理；本研究旨在揭示苦参甘草组方防治NAFLD作用的分子位点，为该方临床治疗NAFLD提供实验依据，为中药组方的现代化提供新的研究思路。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）临床高发，持续的内质网应激及线粒体损伤是导致NAFLD发生发展的重要因素，NAFLD发生时中肝细胞胞浆钙离子水平升高，可加剧内质网应激及线粒体损伤，而内质网钙离子稳态是调控胞浆钙离子浓度的关键，其中IP3R及SERCA是调控内质网钙释放及再摄取的关键位点，疾病发生时IP3R过度激活及SERCA活性抑制导致的内质网钙离子过度释放是导致胞浆钙升高的主要原因。本研究旨在通过研究苦参甘草组方对肝细胞内质网钙离子释放与再摄入的双向调节作用，明确苦参甘草组方对非酒精性脂肪肝的改善机制。通过研究我们发现苦参甘草组方可改善脂肪肝小鼠肝脏脂肪性及炎性病变，参与肝脏脂代谢调节并抑制内质网应激反应；其中通过整体动物实验，细胞实验及分子对接研究发现苦参中的苦参碱具有SERCA抑制剂作用，可升高正常细胞胞浆钙离子浓度，病理条件下软脂酸抑制SERCA，而苦参碱发挥竞争性抑制，降低软脂酸导致的胞浆钙升高作用，抑制内质网应激反应发挥保护作用，而甘草中甘草酸对细胞钙离子信号途径没有显著影响作用，通过生物信息学，分子对接及体内外实验发现甘草酸，甘草次酸均可有效调节NAFLD小鼠肝脏视黄酸代谢途径，增加肝中视黄酸含量，其中甘草次酸是醛酮还原酶-AKR1B10抑制剂，可以通过抑制该酶活性，促进视黄酸代谢，而甘草酸无此活性，二者均可通过调控该途径发挥改善NAFLD及NASH的作用。因此通过以上实验本研究初步阐明，苦参-甘草联合使用改善NAFLD及NASH的分子机制，本研究的完成对苦参-甘草组方这一中药组方的开发奠定了理论基础，同时我们研究发现肝-肠循环在代谢综合症的发生中扮演重要作用，而醛酮还原酶家族在肝脏中发挥解毒作用，其在肠道与代谢性疾病的关系有待进一步研究，也为我们下一步研究提供了新的方向。