CRISPR-Cas系统抑制整合子介导耐药基因传播机制研究

Antibiotic-resistant mobile genetic elements along the food chain transmission to humans from animal source bacteria has become a serious trend in Agriculture and animal husbandry.This study is focus on a new clustered regularly,spaced short and palindromic repeat CRISPR-Cas system, which was found having the ability to withstand the invasion of exogenous genes. Based on the detected antibiotic-resistant strains from food source mediated by integron, we analyse the gene structure of CRISPR-Cas system and integrase by bioinformatics, constructe CRISPR-Cas system with specific integrase recognition sites and plasmid containing integrase and resistance gene cassette using molecular biology method,and remove the effects of CRISPR-Cas gene by allelic recombination .Antibiotic-resistance and integration efficiency detection,together with mRNA level detection using real-time PCR are also using in this study.This study aims to explore suppression of microbial atibiotic-resistance spread from gene level and to lay the foundation for the CRISPR-Cas system used in prokaryotes, providing experimental and theoretical basis to controlthe problem of antibiotic-resistance caused by integrons.

本研究针对农牧业中动物源性细菌携带的可移动耐药基因元件沿着食物链向人类传播日益严重趋势，利用近年在原核细胞基因组中发现的一类新的规律成簇间隔短回文重复CRISPR-Cas系统对外源基因入侵有抵御能力，研究对整合子系统传播耐药性的抑制作用。以本实验室检测的整合子介导的耐药菌株为基础，通过生物信息学分析整合酶、CRISPR-Cas系统基因结构，分子生物学手段构建带特异性识别整合酶位点 CRISPR-Cas 系统及含整合酶和耐药基因盒质粒，等位重组去除CRISPR-Cas 系统各效应基因，分别用检测微生物耐药性、整合效率、Real Time-PCR 检测基因 mRNA 水平变化探索 CRISPR-Cas 系统抑制整合子-耐药基因盒传播的基因机制。本课题从基因水平探索抑制微生物耐药传播问题，为 CRISPR-Cas 系统用于原核生物奠定基础，对控制和解决整合子引起的耐药问题提供实验依据。

微生物多重耐药性对人类健康构成了迫在眉睫的威胁。细菌多重耐药性的获取和传播依赖于多种机制，其中最常见的是由1类整合子介导的耐药基因的水平基因转移。迄今为止，人们尚未开发出有效的策略来应对日益恶化的细菌多重耐药性。为了解决这一问题，我们研发了CRISPR-Cas9和CRISPR-dCas9干扰系统，以野生型接合质粒R388上的1类整合子为靶标，致力于缓解大肠杆菌中1类整合子介导的多重耐药性。. 正如预期那样，开发的CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中造成了1类整合子的双链DNA断裂，这导致I类整合酶基因inti1，编码甲氧苄胺嘧啶抗性的dfrB2耐药基因盒，编码磺胺甲异噁唑抗性的sul1基因和编码耐受季铵盐化合物消毒剂的qacEΔ1基因的转录水平降低了30〜50倍。I类整合子中耐药基因mRNA的减少导致了实验菌株的抗药表型发生了改变：实验菌株对甲氧苄胺嘧啶，磺胺甲恶唑和季铵化合物消毒剂的复敏率分别为99.26％，99.33％和99.37％。因此，本研究中构建的CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中成功发挥了作用并显示出较高DNA切割活性，减少了质粒R388上1类整合子的拷贝数。. 除了DNA切割活性外，我们还研究了CRISPR-dCas9干扰系统介导的转录抑制功能。我们使用CRISPRi系统靶标R388质粒上的1类整合子，实时荧光相对定量PCR分析显示：dfrB2基因盒和sul1基因的转录分别下调了37〜97％和21〜84％；MABA (Microplate Alamar Blue Assay) 试验结果显示：对甲氧苄胺嘧啶和磺胺甲恶唑的半效应浓度（IC50）分别降低了8倍和2〜32倍；转录分析和细菌接合实验表明：1类整合酶inti1基因mRNA的表达量下降了70〜96％，而1类整合子介导的aadA1，aadB和cmlA三种耐药基因盒的水平基因转移效率降低了10〜1000倍。总体而言，经过工程改造的CRISPRi系统可同时有效地抑制大肠杆菌中由1类整合子介导的抗生素耐药性和耐药基因盒的水平基因转移。据我们所知，这是第一个利用CRISPR和CRISPRi系统通过靶向细菌整合子来减轻微生物多重耐药性的研究，这为未来研发基于CRISPR和CRISPRi的新型抗菌剂和细胞疗法来减缓细菌多重耐药性提供了宝贵的见解。