电针干预脑梗塞后神经血管单元构型调整的分子机制和远期效应研究

Neurovascular Unit is the key structure for neural function recover after stroke,Reconstruction of neurovascular unit and long-dated effect after ischemic stroke treated by electroacupuncture were investigate in this research to detect the cross-talking and connection re-establish pattern between proliferate Endothelial cells(EC),neurons，astrocyte and pericyte,we design this research to prove the hypothesis that the neurons is closely related to the EC through astrocyte and pericyte in the ischemic penumbra area and the differentiation of neurons is depend on nutrition supply of capillaries which were made up by new born EC after brain infarction.In this research,the acute cerebral infarction rat model were made by Middle Cerebral Artery Occlusion,to investigate the distribution of EC,neuron,astrocyte and pericyte in the ischemic penumbra area,we use BrdU method to maker the DNA of EC,use immunoflorescence labling method to mark EC,neuron,astrocytic glial and pericyte,and use electron microscope to observe.To reveal the meleculor mechanism for this effect,we use Westren blot method to detect the key neurotransmitters and their receptors,use real time quantaitative PCR method to test the RNA expression of those proteins.Summarize all to analyse the molecular machenism of electroacupuncture intervention on neurovascular construction regulation and the long-dated effect after brain infarction.

神经血管单元是脑梗塞后神经功能恢复的核心结构基础，我们前期的研究证实电针能够促进脑梗塞后血管内皮细胞增殖，本课题旨在进一步研究电针对血管内皮细胞、神经元、星状胶质细胞和外膜细胞之间重建关联的干预作用、分子机制和远期效应。研究以脑缺血再灌注大鼠模型为研究对象，以电针促进脑梗塞后血管内皮细胞增殖为切入点，探讨神经元、星状胶质细胞和外膜细胞与其重建关联的相互作用模式，电针调节的分子机制以及远期效应。研究采用BrdU掺入法检测增殖细胞DNA，免疫荧光标记检测双皮质激素（DCX）、血管内皮细胞粘附因子（PECAM-1）、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经纤毛蛋白1（NRP1）的表达和分布特征，实时定量PCR和Western Blot技术测定关键蛋白和基因的表达变化规律，从基因表达、蛋白功能和细胞分布改变三个层面，揭示电针干预脑梗塞后神经血管单元构型调整的分子机制及神经功能恢复的远期效应。

神经血管单元结构包括微血管内皮细胞、星状胶质细胞、外膜细胞和神经元，对这一结构整体的深入研究更为清晰地揭示了脑梗死后的病理生理改变过程，并且为临床研究提供了新的方向和治疗切入点，进而发展为血管神经网络的概念。本研究旨在分析电针对脑梗死后侧枝循环建立，血管新生的干预作用，并分析其对神经血管单元重建作用。. 本研究包括三个层面的内容：首先，通过形态学研究从细胞层面揭示脑缺血再灌注后神经血管单元的分布特征；其次，通过检测关键调节蛋白的表达，从蛋白水平揭示影响神经血管单元内各细胞联系的关键蛋白的表达变化；最后，通过对关键蛋白基因表达的检测，分析其分子调节机制。. 研究结果：激光多普勒检测显示：MCAO即刻，模型对照组梗死侧皮层局部脑血流量下降至MCAO前的25.30±1.76%，对侧皮层局部脑血流量亦同时下降至86.66±1.66%，其后，双侧皮层局部血流量均有小幅上升，但无显著差异。电针干预后双侧皮层局部血流量显著上升，梗死侧局部脑血流量平均增加20%，在各时间节点上与模型对照组比较均有极显著差异。对侧皮层局部脑血流量在电针干预后上升至接近正常水平，均高于模型对照组。凝集素染色结果显示：在MCAo后1，3，6小时，模型对照组梗死区周围脑血管量均显著减少，电针干预组相比较则均有增加，梗死区脑血管量下降更为显著，电针干预组相较则均有增加。免疫荧光双标记染色结果显示：模型对照组MCAo再灌注后血管内皮细胞增殖24小时开始出现，3天时达到高峰，7天时增殖水平已有下降。电针干预组血管内皮细胞增殖在各时间节点均多于模型对照组。. 基因检测结果显示：采用FPKM估算样本中的基因表达量，通过NOISeq软件包对1d、2d、3d、7d、14d、28d电针组和对照组数据进行差异表达分析，结果显示：与对照组比较，VEGFA、Ang1、GFAP蛋白基因在电针后1d、2d、3d表达呈下调趋势，7d、14d、28d表达以上调为主。Nestin蛋白基因在电针1d、2d、3d基因表达呈上调趋势，7d、14d、28d基因表达呈持续性下调。Tubb3、NCAM1蛋白基因表达在各时间节点上均以上调为主。. 研究结果证实电针能够有效改善脑梗死超早期侧枝循环建立，增加脑血流灌注，促进血管内皮细胞增殖，为神经血管单元重建提供有利条件。