恶臭假单胞菌小基因组菌株构建和异源表达多样化有机污染物分解代谢途径

Pseudomonas putida KT2440 is a model strain and safe to the environment, and its genome has been sequenced. In this study, the construction of the minimal genome of P. putida KT2440 and heterologous expression of the diverse catabolic pathways in the minimal genome strain will be performed. This study includes: (1) By using the bioinformatics approaches, we may obtain the information on the essential genes, GC islands and the replication origins of this strain, which will lay a foundation for the genome simplification; (2) By using the λRed-mediated DNA recombination, the genome of this strain will be simplified by deleting about 15% of the genome sequence, and a strain with a reduced genome will be obtained, and its growth properties will be explored; (3) We use the minimal genome strain as the chassis cell, 43 degradation genes will be integrated into the different target sites of the chromosome of the host cell by homologous recombination, and the diverse catabolic pathways for the complete mineralization of γ-hexachlorocyclohexane, naphthalene, atrazine, p-nitrophenol and trichloropropane will be constructed in this strain (the reason for the selection of the above five compounds is shown in the text); (4) The minimal genome strain with the diverse degradation pathways will be applied for in situ bioremediation of combination contamination soils, and its adaptability and safety to the environment will also be evaluated.

Pseudomonas putida KT2440是一株对环境安全的模式菌株，目前已经完成了对该菌株的全基因组测序。本项目拟开展P. putida KT2440的小基因组构建和异源表达多样化分解代谢途径研究，主要内容如下：（1）利用生物信息学手段，分析获得必需基因、基因组岛和复制原点信息为基因组的精简奠定基础；（2）利用λRed系统介导的线性DNA重组，对该菌进行15%左右的基因组精简敲除，构建P. putida KT2440的小基因组，探索小基因组微生物生长发育规律；（3）以小基因组菌株作为底盘细胞，通过同源重组将43个降解基因整合至宿主菌染色体中不同靶位点，在该菌中构建出能够完全矿化林丹、萘、阿特拉津、对硝基苯酚和三氯丙烷的分解代谢途径（选择上述5种化合物的理由见正文）；（4）利用具有多样化降解途径的小基因组菌株对复合污染土壤进行原位修复，评价菌株的环境适应性和安全性。

恶臭假单胞菌KT2440是环境微生物模式菌株，其基因组在2002年已被测序和解析。本项目组通过基因组删减来构建Pseudomonas putida KT2440的小基因组菌株。与野生型菌株相比，小基因组菌株KT2440在生长速率、碳源利用、转化效率、外源蛋白表达量和染色体途径整合效率等诸多方面表现出较大优势，因此，本研究构建的一系列KT2440小基因组菌株非常适合作为合成生物学底盘细胞，通过引入特定的生物合成和生物降解途径，来构建出微生物小基因组细胞工厂和超级降解工程菌株。.农田土壤基本上受到两类或两类以上农药的复合污染，因此构建能同时降解不同种类农药的基因工程菌是修复土壤复合污染的有效途径。本项目组利用upp反向筛选标记结合自杀质粒的无痕基因组编辑方法，将不同来源的6个农药降解基因整合进菌株KT2440基因组中的特定位点，构建的工程菌株能高效地降解甲基对硫磷、毒死蜱、呋喃丹、西维因、甲氰菊酯和氯氰菊酯，获得了生物安全、遗传稳定、农药降解谱广的工程菌株。.本项目组利用基因组编辑技术在P. putida KT2440染色体中功能组装甲基对硫磷和γ-六氯环己烷生物降解途径，在该菌株中成功构建MP和γ-HCH彻底矿化途径。构建的工程菌能以MP或γ-HCH作为唯一碳源进行生长繁殖，最终将MP和γ-HCH彻底降解为CO2和H2O，避免了有毒中间代谢产物在环境中的积累。工程菌在实验室模拟的土壤生物修复试验中对MP和γ-HCH表现出高的降解效率，该工程菌有望应用于MP和γ-HCH复合污染土壤的原位生物修复。.本项目组利用基因组编辑技术在P. putida KT2440染色体中功能组装三氯丙烷生物降解途径，将三氯丙烷转化为丙三醇，后者被菌株作为碳源利用。进一步，增强菌株对氧气的利用，改善细胞能量代谢，提高胞内还原力水平，最终构建的工程菌株能高效矿化三氯丙烷，以三氯丙烷作为唯一碳源进行生长繁殖。接种了工程菌株的生物反应器对含有三氯丙烷的废水表现出高的修复效率。