恶臭假单胞菌NCIMB9869降解芳烃污染物3,5-二甲基苯酚的代谢途径研究

3,5-xylenol is one of highly toxic and carcinogenic alkylphenols, which is able to be metabolized by Pseudomonas putida NCIMB 9869. But to date, none of the 3,5-xylenol catabolic genes in P. putida NCIMB 9869 had been identified at the molecular level. Using genomic sequencing and library construction, the complete 3,5-xylenol catabolic gene cluster in P. putida NCIMB 9869 is able to be obtained. The function of each catabolic gene can be identified through gene knockout and complementation, expression in vitro, product identification and enzyme assay. The function and character of the key enzyme involved in the catabolism will be detected after purification. It should be analyzed that the differences and relationships among the different xylenol catabolic pathways. And in this study, for the first time, it will be elucidated that the mechanism for the degradation of 3,5-xylenol by P. putida NCIMB 9869 at molecular, biochemical, and genetic levels. And the diversities of xylenol catabolism will also be explored. Moreover, P. putida NCIMB 9869 used in this study is a good representative for bacteria. And the data present here will be greatly helpful to explore the diverse capability for the microbial aromatic degradation and illustrate the adaptive evolution strategies of microbes using 3,5-xylenol as a model.

3,5-二甲基苯酚是高毒性和潜在致癌性的芳烃污染物烷基酚的重要代表之一，恶臭假单胞菌NCIMB9869可将其彻底降解。但该菌株降解3,5-二甲基苯酚的代谢途径无任何功能基因分子水平的研究报道。本研究拟以恶臭假单胞菌NCIMB9869为研究对象，通过基因组测序、文库构建等方法获得完整的3,5-二甲基苯酚代谢基因簇，结合基因敲除互补、体外表达、酶活测定和产物鉴定等方法鉴定其生理学功能；纯化代谢途径中的关键酶，进行酶学特性研究；分析二甲基苯酚同分异构体微生物代谢途径之间的差异和进化关系。本研究将首次从分子、生化和遗传学水平上阐明3,5-二甲基苯酚完整的代谢途径，并揭示二甲基苯酚同分异构体微生物代谢途径的多样性和进化策略。并以恶臭假单胞菌NCIMB9869为代表，以3,5-二甲基苯酚为模式污染物，探索微生物代谢芳烃污染物的代谢机理的多样性及其适应性进化策略。

早期生化研究推测恶臭假单胞菌NCIMB9869中存在完整的龙胆酸代谢异构途径和水解途径，这是目前唯一一例报道的同时具备完整的龙胆酸代谢两条分支途径的微生物，但尚无功能基因的验证及分子水平的报道。恶臭假单胞菌XL501是恶臭假单胞菌NCIMB9869经过保藏中心约四十年的传代保存后的自然突变株，该菌株虽然丧失了利用3,5-二甲基苯酚生长的能力，但通过生物信息学分析，该突变株仍具有潜在的两条龙胆酸代谢途径的编码基因，可对其可能同时存在的龙胆酸开环后两条分支代谢途径的机理开展分子和酶学水平的研究。本研究通过抗生素敏感实验和底物生长实验，确定了恶臭假单胞菌XL501对氯霉素和氨苄青霉素有抗性，对四环素、卡那霉素、链霉素敏感，其丧失了以3,5-二甲酚等甲基酚类物质为唯一碳源和能源生长的能力，也丧失了降解3,5-二甲酚的能力，但是具有利用顺丁烯二酸、D-苹果酸、反丁烯二酸、L-苹果酸、L-酒石酸（其中顺丁烯二酸和D-苹果酸，反丁烯二酸，为龙胆酸代谢直接水解途径和异构途径的中间产物）为唯一碳源和能源生长的能力。通过生物信息学预测了龙胆酸开环后的两条分支途径的完整编码基因，通过分子生物学和酶学研究对编码基因逐个进行了功能鉴定，确定了恶臭假单胞菌XL501中存在龙胆酸开环后的两条分支代谢途径的完整编码基因：xlgL和xlgH编码龙胆酸代谢异构分支途径的关键酶，其中xlgL编码顺丁烯二酸单酰丙酮酸异构酶，xlgH编码反丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶；xlgF1、xlgF2、xlgIJ和xlgA编码龙胆酸代谢直接水解分支途径的关键酶，其中xlgF1和xlgF2均编码顺丁烯二酸单酰丙酮酸水解酶，xlgIJ编码顺丁烯二酸水合酶，xlgA编码D-苹果酸脱氢酶，并且以直接水解分支途径中间产物顺丁烯二酸、D-苹果酸为底物生长时，xlgA的转录被诱导；而以L-苹果酸或3-羟基苯甲酸为底物生长时，xlgA只有本底水平的表达。本项目首次从分子和酶学水平证明了同一株菌中存在完整的龙胆酸开环后两条分支代谢途径的完整编码基因，进一步揭示了微生物中龙胆酸代谢途径的多样性。