生物安全的多功能农药降解工程菌的构建及其在土壤生物修复中的应用

The increase of many human chronic disease incidence in the past several decades correlated with the consumption of pesticide residues in fruits and vegetables, therefore, control of the sources of pollution (i.e. remediation of pesticide-contaminated soil) is essential. The project team plans to use the genome scarless modification technology to insert carboxylesterase genes (CaE B1, CbE E4), organophosphorus hydrolase genes (opd, mpd), the suicide genes (gef, ecoRIR), green fluorescent protein gene (gfp) into the genome of organochlorine-degrading bacteria by homologous recombination, resulting in the biosafe, stable and multifunctional pesticide-degrading bacteria. The engineered bacteria can simultaneously degrade organochlorines, organophosphates, carbamates and pyrethroid pesticides. The expression of double-suicide system is induced, leading to the effective damage to the cell membrane of the engineered bacteria, chromosomal DNA and recombinant plasmid DNA, which control the escape of genetically engineered bacteria and recombinant gene transfer in environmental remediation. The soil in situ remediation experiments are performed with the engineered bacteria, and the effects of environmental factors on the ability of the engineering bacteria to remove the pesticides in soil are investigated. The activity and transfer of the engineered bacteria in soil are monitored by GFP fluorescence.?Therefore, the engineered strains that have broader substrate range, are biosafe, and adapt well to the environment will be obtained.

人类多种慢性疾病发生率逐年增高与食用农药残留的果蔬有直接关系。因此，控制污染源头（即修复农药污染的土壤）至关重要。项目组计划利用基因组无痕修饰技术，通过同源重组将羧酸酯酶基因 (CaE B1 、CbE E4)、有机磷水解酶基因 (opd、mpd) 、自杀基因 (gef、ecoRIR)、绿色荧光蛋白基因 (gfp) 整合至有机氯降解菌基因组中，构建生物安全且遗传稳定的多功能农药降解工程菌。工程菌能同时降解有机氯、有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯农药。通过诱导工程菌的双自杀系统，对工程菌的细胞膜、染色体DNA和重组质粒DNA进行有效破坏，控制基因工程菌的逃逸和重组基因在环境修复中的转移。利用工程菌进行土壤原位修复试验，研究环境因子对工程菌去除土壤中农药的效率的影响。利用GFP荧光监测工程菌在土壤中的活性和转移。获得降解谱广、生物安全、环境适应性强的多功能农药降解工程菌。

人类多种慢性疾病发生率逐年增高与食用农药残留的果蔬有直接关系。因此，控制污染源头（即修复农药污染的土壤）至关重要。本项目主要完成了以下研究工作：（1）利用枯草芽孢杆菌168的双精氨酸转位途径，通过融合表达双精氨酸信号肽和有机磷水解酶，实现了Bacillus subtilis胞外分泌表达有机磷水解酶；利用微生物细胞表面展示技术，以冰成核蛋白为锚定模序，将植物螯合素展示在农药降解菌的细胞表面，构建出既能降解农药又能高效吸附重金属的工程菌；（2）建立了恶臭假单胞菌的基因组编辑技术，即：利用自杀质粒结合upp反向筛选标记，通过基因同源重组实现对生物安全菌株Pseudomonas putida KT2440基因组的无痕修饰，包括基因敲除、外源基因插入等，为该菌株的代谢途径改造提供了强有力的技术手段；利用上述建立的基因组编辑技术，将化学合成的各种农药降解基因及其表达调控元件，准确地插入P. putida KT2440基因组中的靶位点，构建出生物安全的多功能农药降解工程菌，构建的工程菌能够降解有机氯、有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯农药；（3）利用上述构建的多功能农药降解工程菌进行农药污染土壤生物修复研究。下一步，计划利用以上构建的多种农药降解工程菌作为土壤复合降解菌剂，应用于原位生物修复混合农药污染土壤，最终获得遗传稳定、环境安全、适应性强、农药降解谱广的新型复合降解菌剂。在该项目实施过程中，本人以第一作者或通讯作者发表8篇SCI论文，申请2项中国发明专利，培养硕士生1名和博士生4名。