结核杆菌经DC-SIGN抑制巨噬细胞自噬介导固有免疫逃逸的作用和机制研究

Mycobacteruim Tuberculosis (MTb) can escape from the killing and elimination mediated by innate immune response by inhibiting autophagy. The hypothesis of this study is that DC-SIGN, one of pattern recognition receptors (PRRs) on the surface of macrophages, could inhibite the autophagic function of macrophges via IL-10 dependent pathway, and mediated the innate immunoescape of MTb. There is no related papers on the hypothesis currently. Based on it, MTb infected macrophages ( The DC-SIGN overexpressed THP-1 cell and DC-SIGN deleted THP-1 cell by TALEN) were used as the cell models to analysis the effect of DC-SIGN on the autophagic function of MTb infected macrophages by evaluating the formation and maturation of autophagosome and the autophagic killing; to further analysis the potential signal pathway involved in autophagic inhibition by measuring the level of IL-10 / autophagy related signal molecules and the phospharylation and interaction of these molecules, or by knocking down the key molecules using RNAi techniques. In order to clarify that DC-SIGN mediated MTb innate immunoescaping by inhibiting autophage of macrophages, and the inhibition of DC-SIGN on autophagy is IL-10 dependent and the potential signal molecules involved.This study belong to the key research area supporting by NSFC, and the innate immunoescape mechanism of MTb mediated by innate immune recognition molecules could be better demostrated in this study.

结核杆菌（MTb）可通过抑制自噬介导固有免疫逃逸。本研究创新假说:模式识别受体DC-SIGN可通过IL-10依赖方式抑制巨噬细胞的自噬，从而介导MTb的固有免疫逃逸。目前本假说尚未见。故以此为靶点，利用MTb感染的巨噬细胞（DC-SIGN稳定表达THP-1细胞，及利用TALEN技术建立的DC-SIGN缺失THP1）为模型。分析DC-SIGN对MTb感染巨噬细胞的自噬功能（自噬体形成、自噬溶酶体成熟及自噬依赖的胞内杀伤）的影响；进一步检测 IL-10/自噬相关信号分子的水平、磷酸化水平及分子间作用；以RNAi技术干扰关键分子，探讨介导自噬抑制的可能信号途径。旨在揭示DC-SIGN信号可抑制巨噬细胞的自噬，并介导MTb固有免疫逃逸；且此抑制是通过IL-10依赖的方式介导及可能参与的信号分子。本研究属于自然科学基金资助的核心研究领域，有利于更好地理解固有免疫识别分子介导的MTb免疫逃逸机制。

结核病（TB）是我国重点控制的三个重大传染病之一，每年夺走全球150万人的生命。目前，疫苗不能控制流行，抗结核药物有毒性并导致耐药菌株产生，免疫治疗成为新策略。巨噬细胞既是固有免疫防御细胞，也因结核杆菌（Mtb）能逃逸其杀伤，成为其避难所，自噬诱导可重启其对Mtb的杀伤，成为抗TB固有免疫治疗的重要靶点。DC-SIGN，是其重要的模式识别受体，作为Mtb受体，与结核易感性相关，也是炎症调控的关键靶点。本研究假说:DC-SIGN可通过抑制巨噬细胞自噬，介导MTb的固有免疫逃逸。基于此，本研究建立膜结合型和可溶性DC-SIGN（mDC-SIGN、sDC-SIGN）稳定表达THP-1细胞，利用CRISPR-Cas9技术建立DC-SIGN缺失THP-1细胞模型，用rBCG（表达GFP）感染，建立Mtb感染的巨噬细胞模型。分析DC-SIGN对MTb感染巨噬细胞的细胞表型和自噬功能（自噬体形成、自噬溶酶体成熟及自噬依赖的胞内杀伤）的影响；并分析自噬相关信号分子及其磷酸化水平，探讨可能信号途径。发现：mDC-SIGN和sDC-DIGN过表达都促进对BCG的吸附和摄取，下调PMA刺激诱导的自噬，有利于BCG在细胞内存活。DC-SIGN敲除则导致BCG感染率下降，自噬水平上调。CQ可诱导BCG感染mDC-SIGN细胞内LC3积聚，但免疫荧光染色未见BCG与LAMP1共定位，反映了BCG可诱导自噬体形成，但不能促进其与溶酶体有效融合，自噬流受阻，不利于BCG清除。BCG感染mDC-SIGN、sDC-SIGN细胞，下调其mTOR磷酸化水平，促进自噬，该影响与TLR4信号途径无关。DC-SIGN途径还可以影响BCG感染对促炎症细胞因子（IL-1β）及抑炎症细胞因子（IL-4、IL-10）的表达，参与对巨噬细胞生物表型的调节。本研究还使用野生及突变型Rv2629过表达及敲低的耻垢分枝杆菌或H37Ra作为载体，分析了Rv2629潜在的生物学作用。发现Rv2629可通过抑制临床耐药株生长，诱导其进入迟留状态，诱导其表型耐药。本研究初步揭示了固有免疫识别分子DC-SIGN信号通路通过影响巨噬细胞自噬来介导对Mtb的固有免疫逃逸作用，有利于更好地理解固有免疫识别分子介导的MTb免疫逃逸机制；并探讨了Mtb耐药的潜在机制。属于自然科学基金资助的核心研究领域，为临床进一步防治TB提供理论依据和新靶点。