中药强极性组分新型双水相高速逆流色谱分离及调控机理研究

High-speed counter-current chromatography is a separation technique based on the partition of solutes between two immiscible liquid phases without solid phase. Existing two-phase solvent systems for high-speed countercurrent chromatography cover the separation of hydrophobic to moderately polar solvent systems, but often fails to provide a suitable partition coefficient values for highly polar polyphenols. Our previous studies demonstrating that hydrophilic organic/salt-containing aqueous two-phase system which composed of alcohol, salt and water at various volume ratios has proved itself useful, particularly for the extraction of compounds with high polarity from traditiongal Chinese medicine. In this study, we tested the application of those systems in high-speed countercurrent chromatography, creating a new countercurrent chromatography technology for the separation of polar compound from traditional Chinese medicine . The main research might include two missions, one is the partition mechanism of solution and the other is the retention characteristic of hydrophilic organic/salt-containing aqueous two-phase system in the unique exogenic force field with periodic oscillation formed by using rotation and revolution of helical coils of high-speed countercurrent chromatography. This research work will helpful to broad the application scope of high-speed countercurrent chromatography on phytochemistry, and promote the development of traditional Chinese medicine materials, particularly high-polarity polyphenols.

高速逆流色谱技术在中药物质基础研究中发挥了重要作用，但现有的溶剂体系对于强极性中药药效物质的分离确无能为力。我们在前期研究中发现，新型双水相体系由亲水性醇、无机盐和水组成，与传统的双水相体系相比，体系极性更强，且廉价、环保，对中药提取物中的强极性组分有非常好的萃取分离效果。为了高效、高通量地实现强极性中药药效物质的分离制备，我们将新型双水相溶剂体系与广泛应用高速逆流色谱结合，建立新型双水相高速逆流色谱新技术，研究新型双水相体系在高速离心力场下的选择性分配机理和调控机制，解决溶剂体系的选择和固定相保留问题。此研究将为新型双水相高速逆流色谱的实际应用提供理论支持，为强极性中药药效物质的分离制备提供新思路、新方法，促进中药药效物质基础和现代化研究。

强极性中药组分的分离与表征一直是中药物质基础研究的难点，这主要是因为强极性化合物的分子结构中大多含有羧基、磺酸基、氨基、糖基等极性基团，这些基团的存在大大增加了化合物的亲水性使其在有机溶剂/水两相溶剂体系高速逆流色谱保留较弱，甚至无法保留。本项目将新型双水相体系引入到高速逆流色谱中，完成了亲水性醇/盐双水相体系及其拓展的多元体系和有机溶剂/亲水性醇/盐三液相体系等新型双水相体系的构建，建立了基于上相含水量的三元新型双水相体系极性表征和基于Rohyschneider-Snyder polarity (P’)参数的多元新型双水相体系的极性表征方法，为溶剂体系的选择提供有效方法；明确高速离心立场下溶剂体系的单向性流体特征，建立与之相适应的洗脱方法，克服了固定相保留问题；实现了亲水性化合物咖啡酰奎尼酸同分异构体、二羟基苯甲酸同分异构体及四种核苷酸的分离。该方法无须精细的样品前处理，且无不可逆吸附和柱效降低问题，在强极性中药药效物质研究方面具有强大的优势。.本项目将建立的亲水性醇/盐双水相体系和有机溶剂/亲水性醇/盐三液相体系成功用于强极性化合物的萃取分离，取得了良好的结果。用乙醇/ Na2CO3体系（pH13）液-液萃取，可将水飞蓟宾A、B混合物中杂质2,3-顺-水飞蓟宾B的峰面积由原来的0.1%提升到5.43%，实现转化和萃取一步完成。利用正己烷/乙醇/ K2HPO4三液相萃取体系，有效去除脂肪、蛋白质、糖分等杂质，高效富集中药制剂中的肝毒性吡咯里西啶生物碱，回收率大于70%。利用亲水性醇/盐双水相体系高效液-液萃取处理人血浆样本，结合Nano级液相色谱串联质谱多反应监测模式，实现了人血浆中10pg级催产素同位素内标定量分析，为了解催产素与抑郁症之间关系提供了研究方法。此外，还发展了可将新型双水相高速速逆流色谱与制备液相色谱联用的trap-column接口技术。在本专业顶级期刊Journal of Chromatography A发表论文3篇，申请发明专利6项（授权3项），培养博士研究生1人。