乙肝病毒precore和e抗原通过结合NEMO抑制NF-κB信号通路的功能与机制研究

Hepatitis B virus (HBV) e antigen (HBeAg) and its precursor precore are important immune modulators and play an important role in the counter-defence of host cellular inate immunity. Suppression of NF-κB by HBeAg is regarded as one of the strategies for HBV to evade immune responses and establish persitent infection. Previous studies reported that HBeAg can inhibit NF-κB activity through down-regulating TLR2 expression and interacting with TRAM/MAL; however, HBeAg can also suppress IL-1β-mediated NF-κB activation through other unknown pathways. Our previous study showed that HBeAg and its precursors (precore and p22) can associate with NEMO and thereby inhibit TRAF6 induced NF-κB activation. The current study will investigate the molecular mechanisms of the interactions of HBeAg/precore with NEMO and their effects on NF-κB activity. We will fursther study the physiological functions of HBeAg/precore-NEMO-NF-κB pathway by focusing on its roles in suppression of innate immune responses and promotion of viral replication.

乙肝病毒所编码的HBeAg及其前体precore蛋白作为重要的免疫调节因子，在病毒抵御宿主细胞的先天性免疫方面发挥着重要的作用。HBeAg对NF-κB信号通路的抑制被认为是病毒抵御免疫反应、达到持续感染的重要策略之一。以前的工作虽然报道过HBeAg等通过下调TLR2的表达水平以及与TRAM/MAL蛋白互作能抑制NF-κB活性，但HBeAg不经过TLR2/TRAM/MAL仍然能够抑制IL-1β诱导的NF-κB激活则说明HBeAg仍能通过其它的机制调控NF-κB活性。我们前期的工作发现HBeAg及其前体蛋白precore和p22能够与NEMO相互作用，并能抑制TRAF6诱导的NF-κB激活。本课题将深入研究乙肝病毒HBeAg/precore蛋白通过与NEMO蛋白互作进而影响NF-κB通路活性的分子机制，以及这种抑制作用协助乙肝病毒抵御宿主先天性免疫反应，增加其复制水平，达到稳定感染的生理意义。

先天性免疫反应是宿主细胞对抗病毒感染的重要途径，而病毒也已经进化出很多的策略来对抗宿主的抗病毒反应。乙肝病毒在世界范围内大规模感染，部分原因也是因为乙肝病毒拥有对抗宿主细胞先天性免疫反应的能力从而避免被宿主细胞清除，而且乙肝病毒的慢性感染往往伴随着病毒较高的滴度。.以往的研究表明，乙肝病毒e抗原能够抑制由IL-1β诱导的NF-κB激活，但是其分子机制一直不清楚。我们的研究主要在于探讨乙肝病毒e抗原能够抑制由IL-1β诱导的NF-κB激活的分子机制，我们前期的工作已经发现HBeAg能够和NF-κB信号通路的重要蛋白NEMO相互作用。我们的工作主要围绕e抗原和NEMO，IKK复合物的相互作用关系，以及e抗原对乙肝病毒慢性感染患者的影响展开。.通过酵母双杂交，免疫共沉淀，免疫荧光和荧光素酶报告系统等实验，我们证实了乙肝病毒e抗原和NEMO蛋白的相互作用，以及e抗原能够抑制NF-κB信号通路的现象，我们也用ELISA和荧光定量PCR实验在乙肝病毒慢性感染者的组织样本、血液以及我们自己构建的能够被HBV感染的HepG2-NTCP稳定表达细胞系中检验了e抗原对NF-κB活性及NF-κB信号通路下游因子的影响。.结果也显示乙肝病毒e抗原能够结合到NEMO蛋白上，从而调控IKK复合物的活性，e抗原也能够抑制IL-1β诱导的由TRAF6介导的NEMO蛋白的K63位泛素化。接下来，运用NEMO缺失的MEF细胞以及恢复突变实验，我们发现e抗原主要是通过调控NEMO蛋白上5个赖氨酸的K63泛素化水平来行使抑制NF-κB信号通路的功能。.我们最终的结果证实，乙肝病毒e抗原能够抑制由IL-1β诱导的NF-κB活性，其作用机制主要是通过抑制由TRAF6介导的NEMO蛋白的K63泛素化来实现，这可能也是HBV能够感染宿主细胞并形成稳定携带的重要原因。