VapA 在马红球菌逃逸巨噬细胞自噬中的作用及机制研究

Rhodococcus equi is an intracellular pathogen which causes pneumonia for 3 to 6 month old horses. it can also infect patients with immunodeficiecy disease.Virulence-associated-protein A (VapA) is essential for R.equi intracellular survival inside macrophages. VapA disrupts autophagosomes and/or endosomes fuse with lysosomes to form an autolysosome or an endolysosome. Autophagosome and lysosomal fusion play an important role in the elimination of intracellular pathogens. Therefore，we hypothesized that VapA protein may help R.equi escape autophagy by blocking autophagic flow，through inhibiting the fusion of autophagosomes and lysosome in autophagy.To prove this hypothesis, the follwing research will be carried out for this project：①A vapA eukaryotic expression vector is construced and transfected into RAW264.7,which is used to clarify the role and molecular mechanism of autophagy induced by VapA；②Constructing vapA gene knockout and its complement mutant, to determine the effect of vapA gene deletion mutant on macrophage autophagy and the role of R.equi evading macrophage autophagy induced by vapA gene；③throgh mice infection, testing macrophage autophay in mice tissue and its infection outcome induced by vapA gene.The results of this research will help to illustrate the effect and mechanism of VapA within R.equi escape macrophage autophagy.It has a significant contribution to the prevention and treatment of this disease.

马红球菌（R.equi）是3-6月龄马感染最严重的致病菌，感染的马驹呈现化脓性支气管肺炎。该菌也可感染免疫低下人群。VapA蛋白是该菌的必要致病因子，可抑制自噬体/吞噬体与溶酶体的融合。而自噬体与溶酶体的融合在消除胞内病原菌中具有重要作用。推测VapA蛋白通过抑制自噬体与溶酶体的融合，阻断自噬流的形成，有助于R.equi 逃逸自噬。为验证本假说，本项目拟开展如下研究内容：①构建vapA真核表达载体并转染RAW264.7，明确VapA诱导巨噬细胞自噬的作用及分子机制；②构建vapA基因敲除及回补突变株，进一步明确VapA对巨噬细胞自噬的影响及VapA在R.equi逃逸巨噬细胞自噬中的作用；③小鼠感染实验，确定vapA基因在体内诱导小鼠组织巨噬细胞自噬及感染结局的影响。研究结果将有助于阐明VapA 在R.equi逃逸巨噬细胞自噬中的作用及机制，对该病的预防与治疗具有重要意义。

马红球菌（R.equi）是一种人兽共患病病原菌，主要引起3至6月龄马以及免疫缺陷患者肺部相关疾病，病死率高达50 %以上，被感染动物体内分离到的马红球菌均携带一个毒力质粒，毒力相关蛋白A（Virulence associated protein A，VapA）位于该质粒毒力岛上，是该质粒是马红球菌在细胞中增殖必不可少的毒力因子，其可以破坏吞噬体和溶酶体酸化，导致包含病原菌的吞噬泡pH值呈中性，从而帮助马红球菌在巨噬细胞中增殖并引发相关疾病。自噬作为真核细胞内溶酶体依赖的降解途径，可以清除胞内感染的病原菌，在抗感染免疫中起着重要作用。因此，推测VapA蛋白可能通过阻断巨噬细胞自噬流，在马红球菌逃逸自噬清除的过程中发挥着重要作用。本研究通过构建稳转vapA基因的真核表达载体并转染巨噬细胞，利用RT-PCR检测自噬相关基因的表达，初步确定VapA可能抑制巨噬细胞自噬。进一步在利用原核表达体系纯化VapA蛋白，及两次同源重组获得vapA基因的无痕缺失突变株（R.equi103+/△vapA）及其回补突变株（R.equi103+/△vapA/vapA），通过RT-PCR、western blot、免疫荧光及自噬流的检测证明VapA抑制巨噬细胞自噬。通过His-Pull-down、非标记定量蛋白质组学、生物信息学分析和Western Blot及免疫荧光等及CFU等实验，筛选并鉴定出与VapA蛋白与ATPV0D1互作作用，进一步通过干扰及过表达ATPV0D1确定VapA通过抑制ATPVOD1的表达而影响吞噬溶酶体的酸化，帮助R.equi逃逸巨噬细胞自噬。通过气道滴灌法感染野生株与vapA基因缺失突变株，结果显示小鼠肺部感染的马红球菌在5天和10天均已被成功清除。病理组织切片显示vapA基因敲除的突变株感染组的病理改变程度较轻，R.equi野生株组病理改变程度较重，既VapA蛋白可以造成小鼠肺部组织病变。免疫组化结果显示野生株和vapA敲除株均可以上调LC3、P62和ATP6V0D1的表达量，与野生株相比，敲除vapA基因可以下调LC3、P62和ATP6V0D1的表达量，既VapA蛋白可以上调自噬相关蛋白LC3和P62蛋白的表达，表明VapA蛋白可以在小鼠肺组织中抑制自噬。研究结果将有助于阐明VapA 在R.equi逃逸巨噬细胞自噬中的作用及机制，对该病的预防与治疗具有重要意义。