Bcl-2/VDAC1介导的线粒体凋亡途径在牛磺酸抗铁过载所致肝损伤中的作用

Taurine, as a nutrition product and Strengthen food additive, is more and more attracting everyone’s attention. Our previous results showed taurine protect liver against chronic iron-overload by inhibiting mPTP open and reducing ROS generation. This project will be around the main line which is Bcl-2/ VDAC1/RIRR/mPTP/CytC, thoroughly investigate the all links from the molecular nutrition, and then reveal its morlecular mechanism and target. Using CRISPR-Cas9 gene editing technique, the corresponding transgenic mouse liver cells were established. The effects of different expression levels of Bcl-2 or VDAC1 on RIRR and ROS burst, and the protective effect of taurine on hepatocyte against iron overload will be observed. Its molecular mechanism will be explored from mitochondrial membrane potential, ROS system activity, mitochondrial function and so on. Finally, in vivo experiments wil be done in order to certificate the results from in vitro experiments. The aim of this project is to study the molecular mechanism of long-term administration of taurine against iron overload resulting in liver injury by modern molecular biology techniques. It provides theoretical basis for the development of health care function food with taurine as functional factor and also provides reference for basic research on taurine nutrition.

牛磺酸作为营养保健品和强化食品添加剂的重要性越来越引起人们的重视。本项目组前期工作发现：牛磺酸可通过抑制mPTP开放、减少ROS生成而对抗慢性铁过载所致的肝脏损伤，但确切的分子机制不明。本课题拟围绕“Bcl-2/ VDAC1/RIRR/mPTP/CytC”这一主线，从分子营养的角度对各环节进行深入系统的研究，揭示其分子机制及作用靶点。运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，建立相应的转基因小鼠肝脏细胞，观察不同Bcl-2、VDAC1表达水平对RIRR、ROS爆发的影响及对牛磺酸抗肝细胞铁过载保护能力的影响，并从线粒体膜电位、ROS系统活性、线粒体功能等角度探讨其分子作用机制；最后在整体动物实验上进行比较认证。本项目旨在用现代分子生物学技术研究、探讨长期服用牛磺酸对抗铁过载肝脏损伤的分子机制，为开发以牛磺酸为功能因子的保健功能食品提供理论依据，也为牛磺酸营养的基础研究提供参考。

牛磺酸作为营养保健品和食品添加剂的重要性逐渐引起人们的重视，且牛磺酸作为膳食抗氧化剂可降低体内重金属对肝脏的毒性伤害，但是牛磺酸拮抗铁过载保护肝脏的分子机制和作用靶点尚未研究。在这项研究中，我们在细胞和动物水平上验证了牛磺酸对铁过载所致的肝脏损害具有明显的保护作用,并对其保护机制从线粒体凋亡途径进行了进一步地探讨。我们在细胞水平上，探究牛磺酸对铁过载所致的肝损伤是具有保护作用，并从Bcl-2/VDAC1介导的线粒体凋亡对其机制进行了研究。本课题采用CCK-8试剂与流式细胞仪测定细胞存活率和细胞凋亡率，结果发现当牛磺酸的浓度为40mM时，发挥较明显的保护作用，以此作为牛磺酸最佳保护浓度；Western Blot结果显示Iron+Taurine组与Iron+Turine+NC组Bcl-2蛋白表达含量较Control组有所增加，VDAC1蛋白表达减少；采用免疫共沉淀技术检测在牛磺酸处理下Bcl-2与VDAC1的相互作用，得出Bcl-2与VDAC1在正常情况下（Control组）具有相互作用，经牛磺酸处理后，Bcl-2与VDAC1的相互作用增强，且在siRNA Bcl-2慢病毒感染的肝细胞中上述效应被逆转，牛磺酸促进Bcl-2与VDAC1的相互作用被阻断。因此结果提示牛磺酸发挥保护作用可能与其促进Bcl-2与VDAC1的相互作用有关；进一步氧化应激/线粒体凋亡的一系列指标进行检测，结果显示与Iron处理组相比，Iron+Taurine组与Iron+Turine+NC组细胞存活率提高、SOD活性提高、MDA含量降低、线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放程度下降，同时牛磺酸的上述效应可被Bcl-2被敲减所抑制。Western Blot测定线粒体与胞浆中的Cyt c含量显示Iron组细胞色素c(Cyt c)与Control组相比在胞浆中表达明显增加，而在线粒体中表达减少，Iron+Taurine组与Iron+Turine+NC组与Iron组相比在线粒体中表达增加，而在胞浆中表达较少，且牛磺酸的上述效应可被Bcl-2被敲减所抑制。流式细胞仪测定结果进一步证实，Iron+Taurine组与Iron+Turine+NC组与Iron组比细胞凋亡率下降，细胞内活性氧(ROS)水平下降。动物实验也进一步证实，长期喂食牛磺酸能明显对抗铁过载所致的肝脏损害，其机制与Bcl-2介导的线粒体凋亡途径