14-3-3γ/GSK3/β-catenin通路在内毒素耐受交叉保护心肌缺血/再灌注损伤中的作用

previous studies have found that endotoxin tolerance protected against Myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury, but underlying mechanisms were unknown. In light of previous reports and our own work, we hypothesize: Phosphorylated GSK3(phospholated glycogen synthase kinase 3) may be the ligand protein of 14-3-3γ, translocates to cytoplasm with the help of 14-3-3γ, executes Intracytoplasmic regulation for β-catenin, and finally play a protective role of endotoxin tolerance against myocardial I/R injury. Toward this purpose, we will build the endotoxin tolerance and I/R injury models in vivo and in vitro, construct lentivirus vector and establish stable cell lines, identify the interation of 14-3-3γ and GSK3 by co-immunoprecipitation, GST-pulldown and gene site-directed mutation, etc. We will test subcellular location of 14-3-3γ and GSK3 by confocal laser scan microscopy. Simultaneously, we will examine transcriptional activity of β-catenin/TCF by dual-luciferase reporter systerm. Finally, we will find high throughput screen inflammatory related difference expressed genes by gene chip. In this assay, we wil test our hypothesis from molecule, cell and animal levels.Hopefully, the proposed study will help to provide new ideas and new targets for ischemic heart disease prevention and treatment.

前期工作发现：内毒素耐受经上调14-3-3γ蛋白对抗心肌缺血/再灌注（I/R）损伤，但机制不明。根据预实验结果及文献报道，我们推测：磷酸化的糖原合成酶激酶3（GSK3）很可能是14-3-3γ的配体蛋白，在14-3-3γ的协助下靶向定位于胞浆，完成对β-catenin的胞浆内调控，通过影响炎性相关基因的转录最终发挥内毒素耐受抗心肌I/R损伤的保护作用。为此，我们拟建立心肌细胞及大鼠整体的内毒素耐受保护及I/R损伤模型，构建慢病毒载体及建立稳定细胞株，经免疫共沉淀、GST-pulldown、基因定点突变等证实14-3-3γ与GSK3的相互作用；激光共聚焦等检测14-3-3γ、GSK3亚细胞定位；双荧光素酶报告系统检测β-catenin/TCF转录活性；基因芯片检测，高通量筛选炎性相关差异性表达基因等；从分子-细胞-整体层次证明我们的假说。此研究可为缺血性心脏病的防治提供新思路与新靶点

本项目在前期实验证实预处理LPS能对心肌缺氧再灌注（A/R）损伤产生保护作用，在此交叉保护过程中，涉及p38MAPK通路活化介导的14-3-3γ蛋白表达上调。鉴于14-3-3γ蛋白并不是功能蛋白，其主要作用是作为“分子伴侣”协助其它重要的功能蛋白发挥作用，所以本课题拟对14-3-3γ蛋白在小剂量LPS预处理交叉保护心肌细胞对抗A/R损伤的作用进行深入研究，寻找14-3-3γ蛋白协助的功能蛋白，并对其一系列作用机制进行深入研究。研究结果表明：1、免疫印迹及激光共聚焦的结果表明心肌细胞先进行小剂量LPS预处理再行A/R损伤后，14-3-3γ蛋白表达不仅明显上升，而且出现从胞核向胞浆内转移的现象；通过激光共聚焦的结果表明，GSK3β也出现与14-3-3γ一致的亚细胞定位改变，GST-pulldown验证原核融合蛋白 GST-14-3-3γ与真核融合蛋白pcDNA3.1-GSK3β的体外存在相互作用，Co-IP进一步验证实验处理后的心肌细胞中14-3-3γ与GSK3β相互结合；2、构建了GV112/shRNA-14-3-3γ慢病毒载体，沉默14-3-3γ以确定14-3-3γ对GSK3β迁移的影响，证实14-3-3γ作为”分子伴侣”协助GSK3β完成亚细胞定位; 3、构建了GV112/shRNA-GSK3β慢病毒载体，通过改变14-3-3γ及phospho-GSK3β的水平，验证14-3-3γ/GSK3β的相互作用对Wnt通路中β-catenin的调节作用；4、通过检测心肌酶谱、心肌细胞存活率、心肌凋亡、线粒体膜电位及炎性因子，证实14-3-3γ对GSK3β的调控作用会对β-catenin的细胞核转移产生影响，当GSK3β在胞浆内磷酸化失活之后，大量的β-catenin会转移入细胞核，通过对炎性因子的转录调控，使心肌酶谱数值好转，心肌细胞存活率升高，心肌细胞凋亡数下降，线粒体膜电位维持等，发挥了心肌保护作用；5、在大鼠心肌内注射慢病毒载体GSK3β，建立内毒素耐受及I/R损伤模型，结果发现心肌酶谱活性增加，心肌组织中炎性因子水平升高，心梗面积增加，心脏功能下降，心肌组织凋亡增加等；6、取各实验处理组组织，进行基因芯片分析，结合生物信息学分析筛选炎性相关差异表达基因，进一步阐明内毒素耐受交叉保护心肌I/R损伤的主要机制，从抗炎角度为防治心脏I/R损伤提供新靶点。