血管内皮生长抑制因子在膀胱逼尿肌老化中作用机制研究

膀胱逼尿肌老化所致的尿频、尿急、急迫性尿失禁及排尿困难等症状严重影响患者生活质量。膀胱逼尿肌老化的发病与逼尿肌缺血导致肌纤维化有关，也与粘膜下炎症有关。我们在前期研究中首先发现：血管内皮生长抑制因子(VEGi)在膀胱逼尿肌老化患者的膀胱壁内高表达。提示VEGi高表达可能是逼尿肌老化发病的关键环节之一。本课题拟进一步检测人膀胱逼尿肌老化标本中VEGi及其受体DR3的表达；以老年大鼠膀胱为模型，了解 VEGi, DR3, NF-kB, 血管生成，炎症细胞，细胞凋亡等变化；在大鼠膀胱逼尿肌老化细胞中用重组质粒转染和RNAi技术，上调和下调VEGi的表达，研究VEGi异常表达对老化逼尿肌细胞生长、凋亡、DR3和NF-kB表达等影响，以及了解VEGi高表达促进老化细胞凋亡的信号传导通路。从而明确VEGi在膀胱逼尿肌老化中的作用，以期能为临床找到一种既能恢复膀胱血运又能抑制炎症双重治疗目标的新靶点。

膀胱逼尿肌老化所致的尿频、尿急、急迫性尿失禁及排尿困难等下尿路症状严重影响着患者的生活质量。膀胱逼尿肌老化发生的病因和发病机制既与逼尿肌缺血及纤维化有关，也与粘膜下炎症有关。血管内皮生长抑制因子（VEGI）与许多病因如局部缺血、炎症及细胞凋亡等有关，然而，它在膀胱逼尿肌老化中的作用仍不清楚。 VEGI有三种亚型：VEGI-174（TL1）, VEGI-192以及VEGI-251（TL1A）；在人体和动物组织内，VEGI-251是含量最多的亚型。我们在以前的研究中发现，在人体老化膀胱组织内的VEGI-251蛋白和mRNA表达水平要明显高于正常人体膀胱组织。. 通过原代培养老化组及年轻组膀胱逼尿肌细胞，并对逼尿肌细胞及其老化特性进行了特异性鉴定。我们发现：与年轻组相比较，老化组逼尿肌细胞具有明显的老化特性。应用荧光免疫细胞化学技术及Confocal显微成像技术，我们发现：VEGI-251、DR3及NF-κB在膀胱逼尿肌细胞中具有很丰富的表达。应用实时定量RT-PCR及Western Blot技术，成功测定了VEGI-251、DR3及NF-κB在老化组及年轻组逼尿肌细胞中的表达情况并发现：老化组细胞中VEGI-251及DR3的mRNA表达水平均明显增高；老化组细胞中的VEGI-251、DR3及NF-κB的总蛋白表达水平均明显增高；老化组细胞中DR3的膜蛋白表达水平、NF-κB的核蛋白表达水平均明显增高，而DR3及NF-κB的胞浆蛋白表达水平均明显降低。通过上述发现我们推测：VEGI可能通过与膜蛋白受体DR3结合，进一步激活核因子受体NF-κB来发挥其作用。. 运用基因工程技术成功设计出VEGI-251扩增引物和基因敲除引物，并分别构建了重组载体质粒。运用转染技术将上述载体质粒转入膀胱逼尿肌细胞内，以达到VEGI-251在逼尿肌细胞内的高表达或缺失表达。利用Western Blot技术进一步测定DR3、NF-κB及凋亡因子在上述细胞内的蛋白表达情况，来明确VEGI对膀胱逼尿肌细胞老化和凋亡的作用及机制。